摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳法研究池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）和三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）5種組織（鰓、外套膜、腸、閉殼肌和斧足）中SOD和EST同工酶的表達情況。結(jié)果表明，兩種蚌的SOD和EST同工酶均具有明顯的組織特異性。SOD、EST酶譜間存在不同程度的種間差異，可作為鑒定池蝶蚌與三角帆蚌的遺傳標記。

關(guān)鍵詞：池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）；三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）；同工酶；電泳；組織特異性

中圖分類號：S917.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3615-04

池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）與三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）為同屬不同種，池蝶蚌原產(chǎn)于日本滋賀縣琵琶湖。20世紀90年代，中國從日本引進親蚌繁殖馴養(yǎng)成功[1]。同工酶酶譜技術(shù)在水產(chǎn)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[2-7]。有關(guān)池蝶蚌和三角帆蚌的生物學特性研究已有相關(guān)報道[8]，而關(guān)于同工酶的比較研究少見報道。本研究以池蝶蚌和三角帆蚌的不同組織為材料，對SOD、EST同工酶進行了初步研究，探討SOD、EST同工酶酶譜表現(xiàn)模式。

1 材料與方法

1.1 材料

池蝶蚌與三角帆蚌均采自常德市東江珍珠養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 將池碟蚌和三角帆蚌在預(yù)冷的解剖盤上迅速進行活體解剖，剖取外套膜、閉殼肌、斧足、鰓和腸5種組織，用預(yù)冷的生理鹽水洗兩次，在預(yù)冷的玻璃研缽中充分勻漿，并加入3～4 mL預(yù)冷的生理鹽水。把勻漿液用移液槍轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中在5417C/R型高速冷凍離心機上離心（4 ℃，12 000 r/min，20 min），離心2次以上，取上清液即粗酶液分裝于編號的離心管中，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳 參照文獻[9]進行聚丙烯酰胺凝膠的制備及電泳。采用DYY-III-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，整個電泳過程在 0～4 ℃的環(huán)境下進行。用移液槍吸取30 μL粗酶液和25 μL預(yù)冷的40%蔗糖溶液，再加入少許的溴酚藍作為指示劑，每個樣品槽中點樣30 μL。EST同工酶采用穩(wěn)壓進行電泳，開始時將電壓調(diào)至250 V，大約50 min后，溴酚藍指示劑進入分離膠，將電壓調(diào)至200 V電泳[10]，整個電泳過程大約6～8 h。

1.2.3 染色與拍照

1）SOD同工酶。將凝膠板浸泡在2.45×10-3 mol/L NBT溶液中15 min，然后轉(zhuǎn)移到含有0.028 mol/L TEMED、2.8×10-5 mol/L核黃素的0.036 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）中浸泡5 min，最后將凝膠放在0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）和1×10-4 mol/L EDTA溶液中光照到顯色，并采用Gelpro型凝膠成像系統(tǒng)進行拍攝與分析。

2）EST同工酶。以醋酸萘酯做底物，加入堅牢藍和 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.4）[11]中，在37 ℃恒溫箱中進行染色，直到有清晰的酶帶出現(xiàn)，染色時間30 min，并采用Gelpro型凝膠成像系統(tǒng)進行拍攝與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 池蝶蚌和三角帆蚌SOD同工酶分析結(jié)果

池蝶蚌和三角帆蚌SOD同工酶電泳結(jié)果見圖1。在兩種蚌的5種組織中分離出3條SOD同工酶帶，顯示出兩種蚌SOD同工酶的豐富多樣性和組織特異性，SOD同工酶在兩種蚌的不同組織中表達強度不同，在斧足組織中表達最強，鰓、腸中次之，外套膜中最弱。在兩種蚌的同一組織中，SOD同工酶的表達也有差別。

池蝶蚌和三角帆蚌SOD同工酶表達酶譜見圖2。按遷移率的快慢， 以向陽極方向運動最快的酶帶編為SOD-1，由陽極向陰極方向依次編號為SOD-2、SOD-3，其中SOD-1在兩種蚌的5種組織器官都有出現(xiàn)，活性也相當， SOD-2僅在兩種蚌的斧足中出現(xiàn)。以顏色深淺表示酶帶強弱，黑色表示強帶，白色表示弱帶，顏色越深酶活性越強。

根據(jù)Gelpro型凝膠成像分析系統(tǒng)分析顯示，SOD同工酶在池蝶蚌和三角帆蚌5種組織中的表達情況見表1。從圖1、圖2和表1可以看出， 在池蝶蚌和三角帆蚌所有被分析的組織中均有SOD同工酶酶帶檢出，兩種蚌的SOD同工酶的表達既呈現(xiàn)出一些相似的特征，又有明顯差異。兩種蚌的斧足中表達出3條帶分別為SOD-1、SOD-2和SOD-3，腸中有2條帶分別為SOD-1和SOD-3。池蝶蚌的鰓和閉殼肌中都只有SOD-1表達，而外套膜中有SOD-1和SOD-3表達；三角帆蚌的鰓和閉殼肌中均有SOD-1和SOD-3表達，外套膜中只有SOD-1表達。兩種蚌同一組織的SOD同工酶的表達存在差異，表現(xiàn)出明顯的種屬特異性；同種的不同組織中SOD同工酶的表達也有一定的差異，表現(xiàn)出明顯的組織特異性。

2.2 池蝶蚌和三角帆蚌EST同工酶分析結(jié)果

池蝶蚌和三角帆蚌EST同工酶電泳結(jié)果見圖3。在兩種蚌的5種組織中共檢測到4條EST同工酶帶，兩種蚌的EST均具有明顯的組織特異性， 5種組織間酶譜均有差異，其中在斧足組織中酯酶的帶型較復雜，閉殼肌組織中EST的表達量較低。EST同工酶在兩種蚌的同一器官組織中的表達也有差異。

按遷移率的快慢，以向陽極方向運動最快的酶帶編為EST-1，由陽極向陰極方向依次編號為EST-2，EST-3，EST-4（圖4）。其中EST-1在兩種蚌的組織器官都有出現(xiàn)， EST-4僅在兩種蚌的斧足中出現(xiàn)， 表現(xiàn)出一定的相似性。

根據(jù)Gelpro型凝膠成像分析系統(tǒng)分析顯示，EST同工酶在兩種蚌5種組織中的表達情況見表2。從圖3、圖4及表2可以看出， 在池蝶蚌和三角帆蚌所有被分析的組織中均有EST同工酶酶帶檢出。兩種蚌的鰓和斧足均有3條酶帶表達，閉殼肌和外套膜都只表達了2條酶帶，池蝶蚌的腸組織表達了3條酶帶而三角帆蚌只表達了2條酶帶。酶帶的亮度及寬度說明了組織間的差異以及同種組織中不同EST之間的差異，以此說明其組織特異性。兩種蚌的閉殼肌和外套膜都表達了EST-1和EST-2；鰓和斧足均有3條酶帶表達，其中鰓的表達基本一致；斧足的3條酶帶表達有一定的差異，EST-3只在三角帆蚌中表達，而EST-2只在池蝶蚌中表達。因此，EST同工酶的表達在兩種蚌中存在差異，表現(xiàn)出明顯的種屬特異性；同種蚌不同組織間也存在差異，表現(xiàn)出明顯的組織特異性。

3 小結(jié)與討論

3.1 同工酶組織表達特異性的生理意義

SOD和EST在池蝶蚌和三角帆蚌的5種組織中都有分布， 且具有較強的活性，表明這兩種酶對蚌類是至關(guān)重要的[12]。SOD-2、EST-4只在斧足中表達，而在其他組織中不表達，表現(xiàn)出了其組織特異性。蚌類SOD同工酶的含量較豐富，特別是在斧足中表達出3條酶譜帶，與斧足的運動功能是相關(guān)的。酯酶性質(zhì)穩(wěn)定，環(huán)境和反應(yīng)因素對其影響很小，染色后顯帶清晰，重復性較好，在不同的生物體內(nèi)變異較大。因此，常以EST同工酶作為遺傳標志用于物種的分類鑒定、種系發(fā)生和遺傳進化等方面的研究[13]。池蝶蚌和三角帆蚌體內(nèi)不同組織EST的表達具有明顯的差異，顯示出明顯的組織特異性。

3.2 兩種蚌的親緣關(guān)系與種群遺傳結(jié)構(gòu)

SOD和EST在池蝶蚌和三角帆蚌中具有較相似的表達活性及同工酶酶譜， 表明這兩種蚌具有較近的親緣關(guān)系，與傳統(tǒng)分類地位上兩種蚌隸屬于同一屬，親緣關(guān)系較近的結(jié)論相吻合。本研究結(jié)果為兩種蚌之間進行種間雜交提供了科學依據(jù)。SOD和EST同工酶在這兩種蚌的器官組織中出現(xiàn)多態(tài)現(xiàn)象，電泳中的同工酶條帶為基因產(chǎn)物的表達形式。在一個群體內(nèi)個體間某個位點上表現(xiàn)出的條帶差異反映了該群體在該位點上的基因型的多態(tài)。表明這兩種蚌具有可供選擇的等位基因，可用于良種選育，國內(nèi)已經(jīng)雜交選育出了新型品種——康樂蚌。有研究表明利用同工酶分析可計算養(yǎng)殖動物種群的遺傳結(jié)構(gòu)，本研究未能對這兩種蚌的種群遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，有待于進一步研究。同工酶技術(shù)能夠檢測的僅是DNA編碼蛋白質(zhì)的一小部分， 對于揭示蚌類整個基因組的遺傳結(jié)構(gòu)來說， 所提供的遺傳信息較少。目前， 在蚌的種質(zhì)鑒定及品種選育方面已應(yīng)用了隨機擴增片斷多態(tài)性（RAPD）、線粒體DNA的限制性片斷長度多態(tài)性（RFLP） 和微衛(wèi)星（SSR） 等分子技術(shù)[14]，相信隨著分子技術(shù)的深入開展將對蚌新品種的選育作出更大的貢獻。

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