摘要：為了深入了解瘧疾病理過程中TOLL樣受體（TLR）和炎癥反應的關系，通過Real-time PCR、ELISA等方法，測定了小鼠感染伯氏瘧原蟲后其TOLL樣受體（Toll like receptor，TLR）的mRNA水平和下游炎癥因子的血清水平。結果表明，TLR-2、TLR-9、TLR-11的mRNA水平均顯著升高，分別為對照的3.0倍、3.5倍和6.0倍。說明宿主通過TLR感知瘧原蟲的侵入，并啟動下游炎癥因子的過表達。

關鍵詞：TOLL樣受體；Real-time PCR；瘧疾；小鼠

中圖分類號：R382.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3589-04

瘧疾是一種以雌性按蚊為傳播媒介的傳染性疾病，主要流行在熱帶及亞熱帶地區(qū)。在全世界范圍內，瘧疾每年造成至少150萬人的死亡并為許多發(fā)展中國家?guī)沓林氐慕洕摀鶾1]。在中國北緯25°以南地區(qū)，仍有間日瘧和惡性瘧的流行。中緬及中越邊境時有惡性瘧原蟲的輸入病例，并且每年都有因瘧疾感染而導致的死亡[2]。近年來，隨著氯喹等一線抗瘧藥物的普遍使用，抗藥性瘧原蟲在非洲及東南亞地區(qū)日益普遍，以青蒿素為基礎的聯(lián)合化療成為治療瘧疾的首選[3]。但是，近年來在非洲已經出現了青蒿素抗性瘧原蟲，在亞洲的泰國等地甚至出現了青蒿素和氯喹雙重抗性的瘧原蟲[3]。人類在青蒿素之后已經沒有任何新的治療藥物或者手段來對抗瘧疾了。所以開發(fā)新的抗瘧藥物或治療方法已成為對抗瘧疾的迫切任務。TOLL樣受體（Toll-like receptor，TLR）是由Lemaitre等[4]于1996年首次發(fā)現。在隨后的研究中發(fā)現TOLL樣受體是機體天然免疫中非常重要的組成部分，在入侵病原突破了機體的機械屏障（如皮膚、黏膜等）后感知入侵病原并隨后啟動下游的炎癥反應。研究表明，TOLL樣受體可以感知細菌、真菌、原蟲等病原微生物的入侵[5]。2005年，Science雜志報道，小鼠的TLR-11可識別弓形蟲的肌動蛋白抑制蛋白樣蛋白[6]。而在瘧疾感染的進程中，TOLL樣受體如何發(fā)揮作用尚無明確報道。本研究通過Real-time PCR等方法驗證TOLL樣受體在瘧疾感染小鼠模型的病理進程中其表達量的變化，以探討TOLL樣受體在這一過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型的構建

1.1.1 試驗動物 4～6周齡昆明鼠90只，雌雄各半，體重18～22 g，購自新鄉(xiāng)醫(yī)學院動物中心。原生動物門伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei），購自北京大學醫(yī)學院寄生蟲學教研室。

1.1.2 感染小鼠 初次感染時，取10只小鼠，然后從液氮中取出凍存的伯氏瘧原蟲（其存在于購得的感染伯氏瘧原蟲的小鼠外周血中），37 ℃解凍復蘇，將血液給每只小鼠腹腔注射0.3 mL。待小鼠外周血被蟲體感染的紅細胞超過30%后，摘除小鼠眼球取血，并加肝素抗凝。2 500 r/min離心20 min，棄上清液，加入滅菌生理鹽水，重新懸浮紅細胞，并重復上述步驟，如此反復洗3次后，加入滅菌生理鹽水并懸浮紅細胞，用于再次感染試驗用小鼠。

1.2 肝臟的提取及保存

將感染小鼠麻醉后從眼球或心臟放血，放血后將其斷頸，打開其腹腔，取出肝臟用液氮速凍并在液氮中保存。

1.3 血清的提取及保存

將小鼠麻醉后，打開小鼠胸腔，用無菌注射器從小鼠心臟直接抽取心臟血液后加入到滅菌EP管中，37 ℃ 2 h，2 500 r/min離心20 min，取上清液，液氮保存。

1.4 總RNA的提取

1.4.1 小鼠處理方法 取40只小鼠隨機平均分為2組，即感染組和對照組，在感染組小鼠經腹腔注射感染伯氏瘧原蟲后，于1、24、96、144 h分別在2組各取5只小鼠麻醉，取心臟血后將其斷頸取其肝臟。取出的血液加入到滅菌EP管中，37 ℃ 2 h，

2 500 r/min離心20 min，取上清液，液氮保存；肝臟用液氮速凍并在液氮中保存。

1.4.2 操作步驟 將試驗要使用的槍頭、EP管等用DEPC水浸泡至少14 h并高壓滅菌，研缽180 ℃干熱滅菌4 h。取小鼠肝臟（不超過20 mg）在液氮中研磨成細粉狀，加入到裂解液中充分渦旋振蕩，之后的步驟按天根試劑公司的動物組織總RNA提取試劑盒說明書進行。提取完成之后再在液氮中凍存。

1.5 反轉錄PCR過程

1.5.1 反轉錄反應

1）在微量離心管中加入總RNA 1 μL，Oligo dT 1 μL，輕輕混勻。

2）70 ℃加熱5 min，立即將微量離心管插到冰上；然后再加入5×M-MLV Buffer（含dTT） 4 μL，dNTP 1 μL，最后補充適量的DEPC水使總體積達到19.5 μL，輕輕混勻。

3）加入反轉錄酶M-MLV 0.5 μL；重新置于PCR儀中，42 ℃ 1 h，94 ℃ 5 min，完成反轉，將反轉產物迅速插冰上，最后放置于-20 ℃保存。

1.5.2 PCR擴增

1）引物序列：針對不同的目的片段TLR-2、TLR-9和TLR-11，引物分別為：

TLR-2引物：上游引物TLR2A 5′-TGGAATGTCACCAGGCTGC-3′，下游引物TLR2B 5′-GTCCGTGGAAATGGTGGC-3′；

TLR-9引物：上游引物TLR9A 5′-TTCTCAAGACGGTGGATCGC-3′，下游引物TLR9B 5′-GCAGAGGGTTGCTTCTCACG-3′；

TLR-11引物：上游引物TLR11A 5′-TCTTTG- ACGCTCGGAACTGTAGCA-3′，下游引物TLR11B 5′-TAGGTCGATGCACAACTGGGTGAA-3′。

以上3對引物的最佳退火溫度分別為57.5、59.0、59.0 ℃。

2）PCR反應體系：反應體系50 μL，即無菌水38 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 3 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，模板1 μL。

3）PCR反應條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，57.5 ℃或59.0 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min，4 ℃結束反應。并對反應產物電泳分析看其是否與擴增目的片段長度吻合。

1.6 連接pMD18-T

將切膠回收的PCR產物4 μL與T Vector 1 μL 65 ℃處理5 min，迅速插到冰上，加入5 μL solution I，16 ℃過夜連接。

1.7 轉化DH5α

將連接產物10 μL加入到50 μL DH5α感受態(tài)細胞中，冰浴30 min，隨后42 ℃熱激90 s，迅速插冰上3 min，加入500 μL不含抗生素的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，3 000 r/min離心4 min，吸取上清液500 μL，棄去，剩下的液體用槍頭吹勻，并涂布在氨芐抗性的固體LB平板上。

1.8 PCR擴增與測序

1.8.1 PCR擴增

1）PCR測序引物設計：模板使用已連接目的基因的T載體。引物使用PCR引物，與上述1.5.2中的引物相同。

2）PCR測序反應體系 ：50 μL反應體系中加入無菌水38 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 3 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，模板1 μL。

3）PCR測序反應條件：95 ℃預變性5 min； 94 ℃變性1 min，57 ℃退火 1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，每次PCR反應均嚴格設立陰性對照。

1.8.2 PCR產物純化及測序 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，切下擴增片段，用上海華舜生物工程有限公司的小量膠回收純化試劑盒純化后直接用于測序?？刂茀^(qū)的測序引物直接使用PCR引物。測序反應使用Perkin-Elmer（PE） BigDyeTM Terminator Cycle Sequence Kit進行反應。在96孔PCR板的每一孔中將反應物Kit 2 μL，引物（10 pmol/ μL）1 μL，DNA模板 1～4 μL混合。反應條件根據PE公司建議條件：96 ℃ 10 s，50 ℃ 15 s，25個循環(huán)；60 ℃ 4 min。測序反應完成后，進行測序純化。其步驟如下：

1）將取下的96孔板帶膜瞬時離心。撕下蓋膜，每孔加入4倍體積的75%異丙醇，振蕩混勻后，靜置30 min。4 000 r/min離心30 min。將96孔板倒置在吸水紙上，800 r/min離心1 min。

2）加入8倍體積的75%異丙醇，蓋好膜后在振蕩器上混勻，靜置2 min，4 000 r/min離心10 min。將96孔板倒置在另一干凈的吸水紙上，900 r/min離心1 min。

3）室溫揮發(fā)殘余異丙醇約10 min，加入30 μL滅菌去離子水，振蕩1～2 min，500 r/min瞬時離心1 min，將96孔板上樣到測序儀上。測序反應產物經純化后在ABI3730全自動測序儀上讀取序列。測序結果顯示所克隆序列與目的序列完全符合。

1.9 實時定量PCR分析

總RNA提取產物在瓊脂糖凝膠電泳后檢測總RNA質量，并進行反轉錄，作為實時定量PCR反應的模板，內參照選用小鼠的β-actin基因。再用Takara公司的SYBR？誖 Premix Ex TaqTM試劑盒在ABI Prism 7500 Sequence Detection System上進行PCR反應，反應完畢后使用ABI Prism 7500 Sequence Detection System自帶軟件進行數據分析。

1.10 ELISA分析

以小鼠血清為材料，稀釋20倍后作為模板進行ELISA反應，操作程序以RD公司說明書為準，反應完畢后在BIO-RAD 680酶標儀上讀數，并按要求繪制標準曲線，再根據標準曲線計算各個指標。

1.11 統(tǒng)計學分析

數據以“平均數±標準差”表示，應用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 TLR-2、TLR-9、TLR-11表達量變化情況

小鼠經腹腔注射伯氏瘧原蟲之后，其紅細胞的感染率在1、24、96和144 h分別為0、6.0%、42.7%和38.2%（圖1）。對TLR-2、TLR-9、TLR-11的mRNA水平進行實時定量PCR反應測定后發(fā)現，上述3個基因的表達量均有顯著升高，其中TLR-2和TLR-9的表達量在96 h時分別為對照組的3.0倍和3.5倍（圖2、圖3），TLR-11的表達量升高達對照組的6.0倍（圖4），與對照組之間差異均達顯著水平（P<0.05）。

2.2 瘧疾炎癥反應過程中主要炎癥反應因子的變化情況

將小鼠的血清用滅菌生理鹽水稀釋20倍后作為模板對瘧疾炎癥反應過程中的主要炎癥因子用ELISA方法進行了測定。結果顯示，相比TOLL樣受體的變化量，各下游炎癥反應因子的變化更為劇烈，可以推斷，TOLL樣受體在感知了入侵病原伯氏瘧原蟲之后啟動了一系列的下游反應，這些下游反應呈逐級放大的趨勢，在反應到達終端的炎癥因子（如IL-6、TNF-α、IL-12、IL-18等）時，這種級聯(lián)反應的效果相當驚人。

ELISA試驗結果顯示，IL-6 在1 h時為36 U/mL，96 h峰值時升高至10 023 U/mL（圖5）；TNF-α在96 h峰值時升高至485 pg/mL（圖6），而其基線水平只有20 pg/mL；IL-12在96 h時達到峰值，為186 pg/mL（圖7）；IL-18在96 h時其血清水平為3 045 pg/mL（圖8）。當TOLL樣受體水平和感染率在貧血癥狀趨于明顯開始下降時，這些炎癥因子水平也迅速下降，下降的因素包括TOLL樣受體水平的降低，也包括在瘧疾感染后期各個機體的正常生理機能遭到嚴重破壞而導致的下降。值得注意的是，在測定的所有炎癥因子中，只有IL-18血清水平沒有隨著感染率和TOLL樣受體水平的下降而下降，在96 h之后仍然持續(xù)升高，其中的機理還有待進一步的研究。

3 小結與討論

本研究重點討論了TLR-2、TLR-9、TLR-11的mRNA水平在伯氏瘧原蟲侵染小鼠模型過程中表達量變化的規(guī)律。其中，TLR-2可以感知瘧原蟲的磷脂酰肌醇，TLR-9則感知入侵微生物的DNA[7，8]，近期研究也顯示人工合成的瘧色素通過尾靜脈注射給小鼠后，也可通過TLR-9途徑啟動下游的炎癥反應[9]。雖然這一觀點尚有爭議，一些學者認為瘧色素本身沒有免疫原性，必須在瘧色素表面附著瘧原蟲的DNA才能有效地啟動TLR-9途徑[10]。TLR-11在2005年首次報道可以在小鼠體內特異性識別弓形蟲的肌動蛋白抑制蛋白樣蛋白[6]。而肌動蛋白抑制蛋白在進化上非常保守，從低等生物到高等生物其氨基酸序列的變化非常小。弓形蟲和瘧原蟲同屬孢子蟲綱生物，所以需要驗證在瘧原蟲侵染過程中TLR-11是否也發(fā)揮了一定的作用。我們通過Real-time PCR方法驗證了在這一過程中上述3種TOLL樣受體表達量變化規(guī)律。結果顯示，TLR-11的mRNA水平在感染后96 h升高至對照的6.0倍。TLR-2和TLR-9也相應升高至對照的3.0倍和3.5倍。同時發(fā)現在TOLL樣受體的mRNA水平升高之后其下游的各種炎癥因子劇烈升高。這些炎癥因子包括IL-6、TNF-α、IL-12、IL-18等。其中IL-12在瘧疾的病理過程中發(fā)揮著重要的作用，IL-12在TLR-11感知瘧原蟲的肌動蛋白抑制蛋白之后其在肝臟中的水平迅速升高，從感染瘧疾的肝臟中分離出的B細胞甚至具有殺傷正常B細胞的能力[6]。在瘧疾的病理進程中，炎癥反應是一把雙刃劍，在感染的初期，這些炎癥因子可以有效地抑制瘧原蟲的繁殖，同時炎癥也是造成瘧疾死亡病例的重要因素，包括由于炎癥反應導致的血腦屏障通透性改變而產生的腦瘧以及后期產生的瘧疾性貧血等。

對瘧疾病理進程中炎癥反應細節(jié)的深入了解有助于我們尋找新的藥物靶點或新的治療手段。例如TOLL樣受體的抗體或拮抗劑是否有助于在瘧疾侵染時適當降低機體的炎癥反應水平，降低炎癥反應對宿主自身的傷害，從而降低瘧疾感染的死亡率等。

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