摘要：利用生物信息學(xué)的方法對無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）GlnR因子與DNA結(jié)合的位點進(jìn)行預(yù)測，篩選出GlnR因子中與DNA結(jié)合的關(guān)鍵位點的氨基酸殘基R47和R48。然后利用重疊PCR的方法將glnR基因上的第139～144位上的堿基CGCCGC突變?yōu)镚CGGCG，使其編碼的2個精氨酸殘基突變?yōu)楸彼釟埢瑢⑼蛔兓蚱蜹A克隆至PMD18-T載體上進(jìn)行測序驗證。測序結(jié)果表明，利用重疊PCR成功突變了這6個堿基，為后續(xù)研究GlnR因子的突變位點對DNA結(jié)合的影響提供了參考。

關(guān)鍵詞：無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）；glnR；DNA結(jié)合位點；重疊PCR；生物信息學(xué)

中圖分類號：R378.1+2；Q-33 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5902-04

DNA與蛋白質(zhì)相互作用的研究是21世紀(jì)生命科學(xué)研究的重要方向之一，闡明DNA與蛋白質(zhì)相互作用的機制，對了解DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因表達(dá)機制，揭示各種生命活動現(xiàn)象具有重要的指導(dǎo)作用[1]。在分子生物學(xué)和信息科學(xué)快速發(fā)展的影響下，生物信息學(xué)在生物研究領(lǐng)域中的指導(dǎo)性作用越來越大。生物信息學(xué)在預(yù)測蛋白質(zhì)與DNA相互作用的結(jié)合位點方面與其他方法相比，可縮短研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用所需的時間[2]，達(dá)到事半功倍的效果。Wang等[3]提供了一項名為BindN的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)（http：//bioinfo.ggc.org/bindrt/），該工具利用支持向量機（Support vector machine，SVM）通過側(cè)鏈pKa值、疏水指數(shù)和氨基酸的分子質(zhì)量這3個特征值來預(yù)測可能的結(jié)合位點的殘基。

GlnR是一種全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，屬于MerR家族，參與多種代謝酶的合成、次級代謝以及轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控[4，5]。其中GlnR在氮源代謝調(diào)節(jié)過程中起重要作用，并通過調(diào)節(jié)氮源代謝與多種細(xì)菌的致病性密切相關(guān)[6]。近年來，隨著羅非魚“突眼病”的暴發(fā)，無乳鏈球菌作為羅非魚的主要致病菌也越來越多被關(guān)注和研究。作為一類重要的致病相關(guān)因子，目前還未見到有關(guān)無乳鏈球菌GlnR因子的相關(guān)報道。

本研究以羅非魚無乳鏈球菌GlnR因子為研究對象，通過基于BindN的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)預(yù)測無乳鏈球菌GlnR因子中可能參與DNA結(jié)合的氨基酸殘基，通過分析這些氨基酸殘基篩選出最具可能性的結(jié)合位點，并利用重疊PCR技術(shù)擴增GlnR突變基因，為后續(xù)研究GlnR因子與DNA的相互作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 GlnR因子與DNA結(jié)合位點的預(yù)測

在本實驗室前期的工作中，已克隆了羅非魚源[a1]無乳鏈球菌yzf707的glnR基因，GenBank登陸號為JQ013525。本研究將此基因編碼的氨基酸序列提交至BindN網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器中，預(yù)測該蛋白中參與DNA結(jié)合的氨基酸殘基位點。

1.2 供試菌株和試劑

2012年于廣西工學(xué)院生物化工實驗室進(jìn)行試驗。無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、大腸桿菌（Escherich coli） JM109由廣西工學(xué)院發(fā)酵工程研究室保存。質(zhì)粒小提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，TA克隆試劑盒、Ex Taq酶購自寶生物工程有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)無乳鏈球菌的glnR基因序列，設(shè)計2對引物，在139～144位上引入突變堿基GCGGCG，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

1.3.2 glnR基因定點突變 利用重疊PCR的方法對glnR基因進(jìn)行定點突變，反應(yīng)原理見圖1。

第一步PCR分別以P1和P2擴增上游片段M1，P3和P4擴增下游片段M2。50 μL體系中加入10×PCR buffer 5 μL、模板1 μL、dNTP 4 μL、引物各1 μL、Ex Taq酶0.25 μL，添加ddH2O至50 μL。以培養(yǎng)12 h的無乳鏈球菌菌液為模板。

其中合成基因片段M1的反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性 10 min后，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。合成基因片段M2的反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性 10 min后，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段（M1、M2）回收。

第二步PCR以P1和P4為引物，以膠回收后的M1和M2為模板。50 μL體系中加入10×PCR buffer 5 μL、模板M1、M2各1 μL、dNTP 4 μL、引物P1、P4各1 μL、Ex Taq酶0.25 μL，加ddH2O至50 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性 10 min后，94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收。

1.3.3 目的基因的TA克隆 大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備按常規(guī)進(jìn)行。將上述回收的DNA片段用TA克隆試劑盒16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物用熱沖擊法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中。取100 μL轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有50 μg/mL氨芐的固體LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)。待長出菌落后，挑取陽性克隆。

1.3.4 序列測定及分析 用質(zhì)粒小提試劑盒對重組陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，雙酶切及PCR驗證后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。使用Vector NTI 11.0軟件分析測序結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)測結(jié)果

BindN網(wǎng)絡(luò)上的預(yù)測結(jié)果表明，glnR基因編碼的123個氨基酸中有21個結(jié)合DNA的位點，有2段區(qū)域結(jié)合位點較為集中，分別是24～28位氨基酸和42～50位氨基酸（圖2）。從凈電荷來看，由于DNA周圍存在強烈的負(fù)電荷環(huán)境，攜帶相反凈電荷的能力即正的凈電荷能力越強的氨基酸，在與DNA結(jié)合的過程中所起的作用越強。精氨酸帶有明顯的強正電荷，因此對DNA的結(jié)合作用相對明顯。從偶極子來看，靜電作用力（包括氫鍵）在蛋白質(zhì)-DNA相互作用方面起關(guān)鍵作用[6，7]，此靜電作用力在量子力學(xué)中可以用偶極子表征，對于偶極子較高的精氨酸來說，參與DNA結(jié)合的可能性同樣較大。在42～50位的結(jié)合位點集中區(qū)域中有2個連續(xù)的精氨酸殘基 （47和48位），得分分別為4分和9分，均較高。結(jié)合上面的分析得出，這2個連續(xù)的精氨酸在GlnR因子與DNA結(jié)合的過程中起著重要的作用。

2.2 glnR突變基因的擴增

以P1和P2為引物，無乳鏈球菌菌液為模板得到一條長度約為150 bp的特異性擴增條帶M1（圖3a）；以P3和P4為引物，無乳鏈球菌菌液為模板得到一條長度約為250 bp的特異性擴增條帶M2（圖3b）；以P1和P4為引物，M1和M2為模板得到一條長度約為400 bp的特異性擴增條帶（圖3c），擴增的3條目的條帶均與預(yù)期大小相符。

2.3 序列測定及分析

將目的片段凝膠塊回收后進(jìn)行TA克隆，陽性克隆提取質(zhì)粒后經(jīng)驗證并測序。測序結(jié)果經(jīng)DNA STAR軟件進(jìn)行載體序列去除后，獲得長度為372 bp的序列。使用Vector NTI 11.0軟件對突變序列和原序列進(jìn)行比對，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，通過重疊PCR，成功將glnR基因上的第139～144位上的堿基由CGCCGC突變?yōu)镚CGGCG，而其他位點完全一致。

3 小結(jié)與討論

生物信息學(xué)在研究蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合位點的方面有著指導(dǎo)性的作用，本研究利用BindN網(wǎng)絡(luò)服務(wù)預(yù)測了羅非魚無乳鏈球菌GlnR因子中21個可能與DNA結(jié)合的氨基酸殘基，并根據(jù)氨基酸殘基的特性以及可靠性的評價選出了2個最具可能的氨基酸殘基。

目前，對于蛋白質(zhì)與DNA相互作用位點的預(yù)測方法有很多，但大多都是通過蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。本研究中得到的GlnR因子的序列同時也在http：//lcg.rit.albany.edu/dp-bind/網(wǎng)站上進(jìn)行重復(fù)預(yù)測，預(yù)測結(jié)果與本研究基本一致。另外，隨著蛋白質(zhì)與DNA相互作用研究的逐漸深入，大量的“蛋白質(zhì)-DNA”復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)被解析[8]，為研究蛋白質(zhì)-DNA之間的相互作用提供了重要的數(shù)據(jù)資源。科學(xué)家通過對結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的分析，能夠觀察到蛋白質(zhì)與DNA之間的分子空間結(jié)構(gòu)，深入研究氨基酸與堿基位點的識別特征，建立合理的、具有化學(xué)以及熱動力學(xué)基礎(chǔ)的預(yù)測模型[9]，這種模型的建立為預(yù)測DNA和蛋白質(zhì)的結(jié)合位點提供了新的思路和方法。

重疊PCR自1989年被應(yīng)用于定向誘變和融合基因構(gòu)建以來，該技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，在基因定點改造[10]、DNA重組構(gòu)建等方面都有相關(guān)報道，重疊PCR的方法為深入研究基因的結(jié)構(gòu)功能特性提供了一種簡便易行的方法。本試驗中采用重疊PCR成功實現(xiàn)了目標(biāo)基因的定點突變，在試驗過程中應(yīng)注意以下幾點：①使用高保真的Taq酶，普通的Taq酶錯配的頻率較高；②第二次PCR反應(yīng)時，2個模板等量混合，且濃度不能太高；③PCR反應(yīng)時，循環(huán)數(shù)不要太多，一般20～25個循環(huán)，以減少錯配的機率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蔡容華，李 強，張建軍，等.DNA-蛋白質(zhì)相互作用研究的方法及其新進(jìn)展[J].生物技術(shù)，2009，19（1）：93-98.

[2] 劉子朋，章宏九，李雅晴，等.生物信息學(xué)方法在判斷DNA結(jié)合蛋白質(zhì)和預(yù)測結(jié)合位點中的應(yīng)用[J].藥學(xué)進(jìn)展，2009，33 （11）：486-490.

[3] WANG L J，BROWN S J. BindN： A web-based tool for efficient prediction of DNA and RNA binding sites in amino acid sequences[J].Nucleic Acids Research，2006，34（2）：243-248.

[4] PULLAN S T， CHANDRA G， BIBB M J， et al.Genome-wide analysis of the role of GlnR in Streptomyces venezuelae provides new insights into global nitrogen regulation in actinomycetes[J]. BMC Genomics，2011，12：175-189.

[5] CHEN P M， CHEN Y Y M， YU S L， et al. Role of GlnR in acid-mediated repression of genes encoding proteins involved in glutamine and glutamate metabolism in Streptococcus mutans[J]. Applied and Environmental Microbiology，2010，76（8）：2478-2486.

[6] CASTELLEN P， REGO F G M， PORTUGAL M E G， et al. The Streptococcus mutans GlnR protein exhibits an increased affinity for the glnRA operon promoter when bound to GlnK[J]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research，2011， 44（12）：1202-1208.

[7] CHOO Y， KLUG A. Selection of DNA binding sites for zinc fingers using rationally randomized DNA reveals coded interactions[J]. Proceeding of the National Academy of Science of USA，1994，91（23）：11168-11172.

[8] LUSCOMBE N M， LASKOWSKI R A， THORNTON J M. Amino acid-base interactions： A three-dimensional analysis of protein-DNA interactions at an atomic level[J].Nucleic Acids Research，2001，29（13）：2860-2874.

[9] 陳 凌，王 飛.基于結(jié)構(gòu)模型的DBP-DNA識別及預(yù)測研究綜述[J].計算機應(yīng)用與軟件，2011，28（5）：142-146.

[10] 王艷軍，楊 謙.一種快速獲得基因密碼子偏愛性改造的方法——SOE-PCR[J].中國生物工程雜志，2008，28（8）：96-99.