摘要：以海藻酸鈉為載體，采用包埋交聯(lián)法制備固定化α-淀粉酶，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最優(yōu)的固定化α-淀粉酶的條件。利用聚乙二醇4 000作為制孔劑，進(jìn)一步制備具有多孔結(jié)構(gòu)的固定化酶。結(jié)果表明，最優(yōu)工藝為海藻酸鈉1.6%，α-淀粉酶0.4%，羧甲基纖維素鈉0.2%，CaCl2 2%，在此條件下，固定化α-淀粉酶的固定效率可達(dá)92.43%。在體系中添加濃度為2.5%的聚乙二醇4 000能使酶活性提高37.61個(gè)百分點(diǎn)，得到的固定化酶的溫度穩(wěn)定性以及pH穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酶。

關(guān)鍵詞：海藻酸鈉；固定化；α-淀粉酶；聚乙二醇

中圖分類號(hào)：Q814.2；TQ925+.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）23-5845-05

α-淀粉酶（α-1，4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶）普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中，它能以隨機(jī)作用的方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內(nèi)的α-1，4葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等，被廣泛應(yīng)用于食品加工、糧食工業(yè)、乙醇工業(yè)、發(fā)酵和紡織業(yè)等多種行業(yè)，是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的酶制劑之一[1，2]。

固定化酶與游離酶相比，具有熱穩(wěn)定性高、保存穩(wěn)定性好、對(duì)變性劑耐受性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可重復(fù)或連續(xù)使用，且易于與產(chǎn)品分離，是食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[3，4]。依據(jù)酶的性質(zhì)和用途，酶的固定化方法主要可以分為以下4種：吸附法、交聯(lián)法、包埋法和共價(jià)結(jié)合法[5]。

酶的固定化可以使用多種載體，其中海藻酸鈉是一種從海藻中提取的親水性膠態(tài)多聚糖，它是由β-（1，4）-D-甘露糖醛酸和α-（1，4）-L-古羅糖醛酸組成的線性高分子化合物，其分子含有自由的羧基和羥基，可溶于不同溫度的水中，生物相容性好，穩(wěn)定、無(wú)毒、成膜性或成球性好，是常用的囊材與載體材料，也常被用作固定化酶的載體[6]。聚乙二醇是一種無(wú)毒的高分子聚合物，與水有極好的互溶性，它的相對(duì)分子質(zhì)量可從幾千到幾萬(wàn)，控制其相對(duì)分子質(zhì)量的大小以及用量，可調(diào)節(jié)海藻酸鈣中孔的尺寸、體積和密度[7]。以聚乙二醇為海藻酸鈉制孔劑，兩者在水溶液中形成均一體系，將兩者混入氯化鈣溶液中時(shí)，海藻酸鈉轉(zhuǎn)化為交聯(lián)的網(wǎng)狀大分子，海藻酸鈣形成固態(tài)，聚乙二醇可以從固態(tài)的海藻酸鈣中溶出，即形成多孔結(jié)構(gòu)的海藻酸鈣。當(dāng)聚乙二醇相對(duì)分子質(zhì)量為4 000時(shí)，海藻酸鈣支架中可形成蓬松均勻的多孔結(jié)構(gòu)，適用于組織工程多孔材料的應(yīng)用[8]。

本試驗(yàn)采用海藻酸鈉包埋交聯(lián)法制備固定化α-淀粉酶，得到最佳的固定效果，并對(duì)游離酶和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了比較。采用聚乙二醇作為制孔劑，為進(jìn)一步提高固定化α-淀粉酶的酶活性，提高α-淀粉酶的酶學(xué)性能提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

試驗(yàn)于2013年5月在武漢工程大學(xué)完成。

AL204型電子分析天平（METTLER TOLEDO）；722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；81-1型加熱磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器廠）；DSHZ-300型多用途水浴恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

試驗(yàn)中使用的α-淀粉酶購(gòu)自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；聚乙二醇4 000購(gòu)自BIOSHARP公司。其余試劑均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司。試劑純度均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 淀粉溶液多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用DNS法標(biāo)定淀粉溶液中的多糖含量[9]。分別取40、60、80、100、120 μL 2%淀粉溶液（m/V，下同），計(jì)算多糖含量，加入1.0 mL稀碘液，用蒸餾水定容至10 mL，混合均勻后在600 nm波長(zhǎng)下比色。以吸光度值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)多糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并列出線性回歸方程。

1.2.2 α-淀粉酶的固定化 取4 mL 4%海藻酸鈉溶液（m/V，下同），1 mL 2%羧甲基纖維素鈉（以下簡(jiǎn)稱CMC）溶液（m/V，下同），2 mL 2% α-淀粉酶溶液，用蒸餾水定容至10 mL，置于磁力攪拌器上混合均勻，用5 mL注射器吸取上述混合液，以10 cm左右的高度逐滴滴入含有0.4%戊二醛的2%氯化鈣溶液（m/V，下同）中，固定0.5 h后濾出小球，用蒸餾水洗滌2～3次，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用[10]。

1.2.3 α-淀粉酶活力的測(cè)定 以200 μL 2%淀粉溶液為底物，加入100 μL pH 6.0的1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液，400 μL蒸餾水，300 μL適當(dāng)稀釋的α-淀粉酶溶液，于60 ℃水浴鍋中準(zhǔn)確反應(yīng)15 min，立即加入1.0 mL 0.1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。從中吸取1.0 mL反應(yīng)液，加1.0 mL稀碘液，用蒸餾水定容至10.0 mL，混合均勻后在600 nm波長(zhǎng)下比色。

固定化酶的活力測(cè)定方法是將上述方法中適當(dāng)稀釋的α-淀粉酶溶液替換為一定量的固定化α-淀粉酶。在60 ℃、pH 6.0的條件下，以每反應(yīng)15 min消耗1 mg多糖的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Image-Pro Plus 5軟件分析固定化酶的直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化α-淀粉酶的單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同濃度海藻酸鈉對(duì)固定化酶活性的影響 分別取濃度為1.6%、2.0%、2.4%、2.8%的海藻酸鈉溶液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，當(dāng)海藻酸鈉濃度為2.0%時(shí)，固定化酶活性最大，當(dāng)海藻酸鈉濃度繼續(xù)增大時(shí)，固定化酶活性有所下降，其黏度增大，難以擠壓成球狀，并且所形成的凝膠小球體積過(guò)大，影響酶與底物充分結(jié)合。

由圖2可知，4種不同濃度海藻酸鈉固定化酶的平均直徑分別為2.61、2.67、2.99、3.02 mm，即當(dāng)海藻酸鈉濃度逐漸增大時(shí)，固定化酶小球的直徑隨之增大。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因在于當(dāng)海藻酸鈉濃度增大時(shí)，單位體積中能與鈣離子結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)量也相應(yīng)增加，進(jìn)而得到直徑較大的固定化酶小球。

2.1.2 不同濃度酶對(duì)固定化酶活性及固定效率的影響 分別取濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的酶液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，當(dāng)α-淀粉酶的濃度由0.2%逐步增加到0.8%時(shí)，固定化酶的活性先增高而后趨于穩(wěn)定，但固定效率卻逐步降低。這主要是因?yàn)楣潭ɑ改z小球內(nèi)固定的酶量先逐漸增加而后趨于飽和，過(guò)多結(jié)合的酶造成酶分子聚集成團(tuán)，酶分子活性中心可能被部分遮蓋，與底物不能充分接觸，從而影響固定化酶活性與固定效率。

2.1.3 不同濃度氯化鈣對(duì)固定化酶活性的影響 分別取濃度為1%、2%、4%、8%的氯化鈣溶液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，固定化酶活性在氯化鈣濃度變化范圍內(nèi)先增加而后逐漸降低。當(dāng)氯化鈣濃度為2%時(shí)，固定化酶相對(duì)活性最高，固定效果最佳。

4種不同濃度氯化鈣制備的固定化酶平均直徑分別為2.74、2.66、2.59、2.52 mm（圖5），即當(dāng)氯化鈣濃度逐漸增加時(shí)，固定化酶的直徑隨之減小。推測(cè)可能是海藻酸鈉中的α-（1，4）L-古羅糖醛酸結(jié)構(gòu)與鈣離子交聯(lián)形成蛋盒（egg-box）結(jié)構(gòu)，氯化鈣主要影響的是交聯(lián)程度，其濃度越高，固定化酶結(jié)構(gòu)的致密程度越高，因此濃度大的氯化鈣會(huì)降低固定化酶的活性與直徑。

2.1.4 不同濃度CMC對(duì)固定化酶活性的影響 分別取濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的CMC溶液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，當(dāng)CMC濃度為0.2%時(shí)，固定效果最佳。固定化酶活性隨CMC濃度的增加逐漸升高，當(dāng)CMC濃度超過(guò)0.2%時(shí)，混合液的黏度增加，固定化酶活性降低。

2.2 固定化α-淀粉酶的正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，最佳固定化酶的制備工藝為A1B2C2D1，其中各因素影響大小依次為A、C、B、D。利用最佳組合淀粉酶0.4%，氯化鈣2%，羧甲基纖維素鈉0.2%，海藻酸鈉1.6%進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到固定效率可達(dá)92.43%。可見(jiàn)，優(yōu)化后的工藝固定效率較高，穩(wěn)定可行。

2.3 固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)比較

2.3.1 pH對(duì)固定化酶與游離酶活性的影響 在最佳工藝條件下，取pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，測(cè)定游離酶與固定化酶的活性，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)pH均為6.0，與游離酶相對(duì)活性相比，固定化酶的相對(duì)酶活變化幅度不大，即固定化酶在pH變化范圍內(nèi)能夠保持相對(duì)較高的酶活，相比游離酶具有更寬的適應(yīng)性。

2.3.2 溫度對(duì)固定化酶與游離酶活性的影響 在最佳工藝條件下，于45～80 ℃測(cè)定游離酶與固定化酶活性，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，游離酶被固定化以后，其最適反應(yīng)溫度由原來(lái)的60 ℃上升至65 ℃，當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)提高時(shí)，固定化酶活性明顯高于游離酶，這可能是因?yàn)楣潭ɑd體提高了酶空間結(jié)構(gòu)對(duì)熱的穩(wěn)定性。

2.3.3 固定化酶與游離酶熱穩(wěn)定性的比較 將游離酶與固定化酶分別在60、75、90 ℃水浴0.5 h后再測(cè)定酶活，以放置在4 ℃冰箱內(nèi)的游離酶與固定化酶作為對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可知，在高溫條件下，固定化酶活性損失明顯小于游離酶，即使在90 ℃水浴0.5 h，其仍能保持33%左右的相對(duì)酶活，而游離酶的相對(duì)酶活只剩不到10%。

2.4 不同濃度聚乙二醇對(duì)固定化酶活性的影響

分別加入濃度為0.5%、1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%的聚乙二醇4 000制備多孔固定化酶，以不加聚乙二醇的樣品作為對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10。由圖10可知，添加聚乙二醇4 000后，固定化酶活性均高于對(duì)照，當(dāng)添加的聚乙二醇濃度為2.5%時(shí)，固定化酶活性最高，比對(duì)照提高37.61個(gè)百分點(diǎn)，明顯有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。

2.5 游離酶與固定化酶米氏常數(shù)的比較

利用Lineweaver-Burk作圖法以1/V對(duì)1/[S]作圖，按照直線在橫軸上的截距（-1/Km）求米氏常數(shù)Km，結(jié)果見(jiàn)圖11。結(jié)果表明，不加聚乙二醇固定化酶的Km為6.1 mg/mL，添加聚乙二醇固定化酶的Km為3.7 mg/mL，而游離酶的Km為2.8 mg/mL，即不加聚乙二醇的固定化酶對(duì)底物的親和力最小，這與固定化載體的空間障礙與擴(kuò)散限制有關(guān)；添加聚乙二醇后，固定化酶形成的多孔結(jié)構(gòu)有利于提高對(duì)底物的親和力，且這2種固定化酶對(duì)底物的親和力均小于游離酶。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)采用海藻酸鈉包埋交聯(lián)法制備固定化α-淀粉酶，探討了最佳的固定化條件，并對(duì)游離酶和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了比較，正交試驗(yàn)的優(yōu)化組合為海藻酸鈉1.6%，α-淀粉酶0.4%，CMC 0.2%，氯化鈣2%，在此條件下固定效率可達(dá)92.43%。在酶學(xué)性質(zhì)方面，固定化酶比游離酶的最適反應(yīng)溫度高，兩者最適反應(yīng)pH相同，且固定化酶具有更寬的適應(yīng)性。在α-淀粉酶的固定化體系中加入濃度為2.5%的聚乙二醇4 000，能使酶活性提高37.61個(gè)百分點(diǎn)。

海藻酸鈉包埋交聯(lián)法制備的固定化α-淀粉酶具有很好的應(yīng)用前景，與游離酶相比，這種固定化方法有利于酶與底物的分離，也便于酶的重復(fù)或連續(xù)使用，更加節(jié)約成本，是一種很好的固定化方法。

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