摘要：以產(chǎn)油酵母菌Y1為供試菌株，通過單因素及正交試驗對其產(chǎn)脂發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)基組成為葡萄糖85 g/L、蛋白胨40 g/L、（NH4）2SO4 10.00 g/L、MgSO4·7H2O 0.300 g/L、Na2HPO4 3.0 g/L、 KH2PO4 2.5 g/L。按照營養(yǎng)成分最優(yōu)組合，100 mL三角瓶裝液量30 mL，液體種子接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，溫度28 ℃，得到的產(chǎn)油酵母菌Y1生物量為20.25 g/L，生物量比優(yōu)化前提高了46.5%。

關鍵詞：產(chǎn)油酵母；營養(yǎng)成分；產(chǎn)脂；發(fā)酵；優(yōu)化

中圖分類號：S963.32+7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5832-04

我國人均石化資源貯量十分有限，而能源需求量卻與日俱增。微生物油脂是石化能源替代品生物柴油的潛在油源。由微生物生產(chǎn)富含多種生理功能的不飽和脂肪酸油脂已引起國內(nèi)外的廣泛重視。因此，微生物油脂的研究將成為新世紀油脂工業(yè)的一個發(fā)展方向[1-3]。微生物油脂，又稱單細胞油脂，是由酵母、霉菌和細菌等微生物在一定的條件下，利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂作為碳源，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的油脂[4]。自然界中一些產(chǎn)油微生物在碳源充足而其他營養(yǎng)成分（通常為氮源）缺乏的情況下，可以在胞內(nèi)大量積累油脂，甚至達到自身干重的60%以上[5]。產(chǎn)油真菌積累油脂過程中可在胞內(nèi)形成一個或多個油脂顆粒[5-7]。與傳統(tǒng)油脂生產(chǎn)相比，微生物油脂生產(chǎn)有許多優(yōu)點，可連續(xù)規(guī)?；a(chǎn)，周期短，所需原料豐富、價格便宜，并可利用工農(nóng)業(yè)廢棄物；且不受季節(jié)、氣候變化限制，可利用細胞誘變、融合及基因工程等技術改良菌種等[8]。

本研究考察了不同碳源、氮源、營養(yǎng)鹽對產(chǎn)油酵母菌Y1細胞生長的影響，通過單因素及正交試驗進行高產(chǎn)培養(yǎng)基優(yōu)化研究，為產(chǎn)油酵母產(chǎn)脂發(fā)酵生產(chǎn)基本配方提供參照，以期為合理利用廉價原料及大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂奠定基礎[9]。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 產(chǎn)油酵母菌Y1：包頭師范學院生物科學與技術學院實驗中心保存。試驗于2012年3—4月在包頭師范學院生物科學與技術學院微生物實驗室完成。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 液體種子培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖、5 g/L （NH4）2SO4、1 g/L KH2PO4、0.5 g/L酵母粉、0.5 g/L MgSO4·7H2O。

基礎發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基：30 g/L葡萄糖、1.5 g/L蛋白胨、2 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、0.5 g/L （NH4）2SO4。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基最適碳源和氮源 選擇葡萄糖作為發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基的碳源，最適濃度為 85 g/L[10]，后續(xù)試驗用此濃度作為葡萄糖基礎濃度。

牛肉膏[10]為發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基的最適氮源，但考慮到牛肉膏成本較高、保存稍有不當極易染菌，所以選取獲得菌體生物量稍低于牛肉膏蛋白胨作為后續(xù)試驗的氮源。

1.2.2 產(chǎn)油酵母菌Y1種子液的培養(yǎng)[11] 取活化后斜面產(chǎn)油酵母菌Y1一環(huán)，接種于500 mL液體種子培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)14 h，備用。

1.2.3 產(chǎn)油酵母菌Y1發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基最適氮源濃度測定 將發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中蛋白胨濃度分別調(diào)整為3、5、8、12、17、23、30 g/L，其他成分不變，以10%接種量接入培養(yǎng)14 h的液體種子，160 r/min，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)14～32 h之間每隔2 h取樣測定發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)液的OD600，然后以蛋白胨濃度為橫坐標，以每個蛋白胨濃度中所測得OD600為縱坐標，繪制曲線圖。

1.2.4 產(chǎn)油酵母菌Y1發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基的營養(yǎng)鹽最適濃度測定 將發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基中營養(yǎng)鹽濃度分別調(diào)整為表1中所示濃度，進行單因素優(yōu)化試驗，其他成分不變（碳源和氮源分別以所測得最適濃度作為后續(xù)試驗的基準濃度），以10%接種量接入已培養(yǎng)14 h的液體種子，160 r/min，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)14～32 h期間，每隔2 h取樣測定發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)液OD600，然后以不同營養(yǎng)鹽濃度為橫坐標，以在每種營養(yǎng)鹽濃度中所測得的平均OD600為縱坐標，繪制曲線圖[12]。

1.2.5 產(chǎn)油酵母菌Y1發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基營養(yǎng)成分正交試驗 將單因素試驗中得到的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基各營養(yǎng)成分最適濃度作為正交試驗各因素濃度水平中間值，建立L25（56）正交試驗[13]。以10%接種量接入已培養(yǎng)14 h的液體種子，160 r/min，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)14～32 h期間，每隔2 h取樣測定發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)液OD600。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)油酵母菌Y1發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基最適氮源濃度

氮源可促進細胞生長，在嚴重缺氮的條件下可觀察到細胞內(nèi)脂類的積累。無機氮有利于不飽和脂肪酸的產(chǎn)生，有機氮有利于細胞增殖[14]。以蛋白胨濃度為橫坐標，以每個蛋白胨濃度的OD600為縱坐標繪制曲線圖，如圖1所示。由圖1可知，在蛋白胨濃度為30 g/L時，OD600達到峰值。說明以葡萄糖作為最適碳源且濃度為85 g/L時，蛋白胨的最適濃度為30 g/L。

2.2 產(chǎn)油酵母菌Y1發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基最適營養(yǎng)鹽濃度

以發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基不同營養(yǎng)鹽的濃度作為橫坐標，以發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)液OD600為縱坐標繪制曲線圖，如圖2～5所示。

在葡萄糖濃度為85 g/L，蛋白胨濃度為30 g/L時，（NH4）2SO4在細胞中可作為氮源的適當補充，并為細胞提供相應的微量元素。由圖2可以看出，在（NH4）2SO4濃度為16 g/L時，OD600達到峰值，說明其最適濃度為16 g/L。

MgSO4·7H2O是酶的激活劑，適量的濃度可以促進菌體生長[15]。由圖3可知，MgSO4·7H2O的最適濃度為0.1 g/L。Na2HPO4、KH2PO4可以維持細胞的滲透壓[15]，由圖4、圖5可知，二者的最適濃度分別為3 g/L和2 g/L。

2.3 產(chǎn)油酵母菌Y1發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的正交試驗結(jié)果

分別以葡萄糖濃度85 g/L，蛋白胨濃度30 g/L，（NH4）2SO4濃度16 g/L，MgSO4·7H2O濃度0.1 g/L，Na2HPO4濃度3 g/L，KH2PO4濃度2 g/L作為正交試驗中各因素濃度水平中間值，進行正交試驗，各因素和水平見表2。發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)液OD600見表3。

由表3可知，各因素影響大小的順序為蛋白胨、MgSO4·7H2O、葡萄糖、Na2HPO4、（NH4）2SO4、KH2PO4，其中對產(chǎn)油酵母菌Y1的OD600影響最大的是蛋白胨，MgSO4·7H2O、葡萄糖、Na2HPO4對OD600的影響居中且影響力較接近，（NH4）2SO4、KH2PO4對OD600的影響最小。正交試驗得到最優(yōu)營養(yǎng)成分組合為A4B4C1D5E3F4。

根據(jù)產(chǎn)油酵母菌Y1發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基最佳營養(yǎng)成分組合A4B4C1D5E3F4進行驗證試驗，測得培養(yǎng)時間為22 h時，發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基培養(yǎng)液OD600為1.031，優(yōu)化前培養(yǎng)液OD600為0.761。離心分離并洗滌得到酵母，測得發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體濕重為44.63 g/L，優(yōu)化前濕重為37.12 g/L。60 ℃烘干至恒重，測得由發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體干重為20.25 g/L，優(yōu)化前菌體干重為13.82 g/L，比優(yōu)化前提高了46.5%。由于在同等條件下，菌體干重（生物量）與油脂產(chǎn)量呈正相關，優(yōu)化后的發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基有助于提供產(chǎn)油酵母菌菌體干重，即可提供菌體油脂產(chǎn)量。

3 小結(jié)

產(chǎn)油酵母菌Y1發(fā)酵產(chǎn)脂培養(yǎng)基營養(yǎng)成分最優(yōu)組合為：葡萄糖85 g/L，蛋白胨40 g/L，（NH4）2SO4 10.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.300 g/L，Na2HPO4 3.0 g/L，KH2PO4 2.5 g/L。按照營養(yǎng)成分最優(yōu)組合，100 mL三角瓶裝液量30 mL，接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，溫度28 ℃，得到的產(chǎn)油酵母菌Y1生物量為20.25 g/L，優(yōu)化后生物量比優(yōu)化前提高了46.5%，表明該營養(yǎng)成分優(yōu)化結(jié)果合理、可行，為產(chǎn)油酵母菌的利用提供參考。

參考文獻：

[1] 薛飛燕，張 栩，譚天偉.微生物油脂的研究進展及展望[J].生物加工過程，2005（1）：23-27.

[2] 趙宗保，華艷艷，劉 波.中國如何突破生物柴油產(chǎn)業(yè)的原料瓶頸[J].中國生物工程雜志，2005，25（11）：1-6.

[3] 咸 漠，甄 明，康亦兼，等.深黃被孢霉生物轉(zhuǎn)化十六醇合成油脂的研究[J].高等學校化學學報，2000（7）：1108-1109.

[4] 邢大輝，潘安龍，薛冬樺，等.深黃被孢霉利用不同碳源產(chǎn)油脂比較[J].生物工程學報，2010，26（2）：189-193.

[5] MENG X，YANG J M，XU X，et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms[J].Renew Energ，2009，34（1）：1-5.

[6] KAMISAKA Y，NODA N，SAKAI T，et al.Lipid bodies and lipid body formation in an oleaginous fungus， Mortierella ramanniana var.angulispora[J]. Biochim Biophys Acta，1999，1438（2）：185-198.

[7] MURPHY D J， VANCE J. Mechanisms of lipid body formation[J]. Trends Biochem Sci，1999，24（3）：109-115.

[8] 薛飛燕，張 栩，譚天偉.微生物油脂的研究進展及展望[J].生物加工過程，2005，3（1）：23-27.

[9] 陳 合，余建軍，舒國偉，等. 產(chǎn)朊假絲酵母1807高產(chǎn)培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國調(diào)味品，2010，7（35）：52-54.

[10] 馬 勇，門中華.一株產(chǎn)油酵母菌高產(chǎn)培養(yǎng)基的碳源和氮源選擇[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（14）：8202-8203.

[11] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗[M]. 第三版.北京：高等教育出版社，1999.

[12] 童一中. 生物統(tǒng)計法[M].長沙：湖南科學技術出版社，1986.

[13] 夏伯忠. 正交試驗法[M].長春：吉林人民出版社，1985.

[14] 徐華順，羅玉萍，李思光，等.微生物發(fā)酵產(chǎn)油脂的研究進展[J].中國油脂，1999，24（2）：34-37.

[15] 吳開云，耿青偉，李紀元，等. 斯達氏油脂酵母高產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2011（2）：150-156.