[摘要]目的：研究植物去屑組合物的最優(yōu)提取工藝，以糠秕馬拉色菌為供試菌，測(cè)定其的抑菌效果。方法：通過管碟法濺試抑菌效果，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定植物去屑組合物的最優(yōu)提取工藝。結(jié)果：植物去屑組合物最優(yōu)提取工藝為70%乙醇回流提取，提取料液比1：25，提取時(shí)間2h，提取溫度65℃時(shí)，植物去屑組合物的抑菌效果最優(yōu)。結(jié)論：植物去羈組合物醇提物對(duì)糠秕馬拉色菌的抑菌活力為高度敏感。

[關(guān)鍵詞]植物去屑組合物，糠秕馬拉色菌，提取，抑菌

馬拉色菌是形成頭皮屑的重要因素之一，馬拉色菌的消長(zhǎng)與頭皮屑的多少具有直接相關(guān)性。目前，抑制馬拉色菌的藥物研究主要以化學(xué)類的抗真菌制劑為主，如酮康唑、氯咪巴唑、吡硫翁鋅等，但此類物質(zhì)刺激性較大，而且容易產(chǎn)生耐藥性。以常用去屑劑吡硫翁鋅（ZPT）為例，張旋等研究證明ZPT對(duì)麥穗魚、青鱂、直突搖蚊亞科2齡幼蟲屬劇毒物質(zhì)。SarahD.等研究指出，ZPT可能導(dǎo)致人類角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的熱休克并引起DNA損傷。雖然，早在1981年美國(guó)FDA就公布并認(rèn)可ZPT在微量用于日用品成分的情況下對(duì)人體沒有危害，但此類物質(zhì)仍存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，研究復(fù)方植物去屑劑具有重要意義。

本研究復(fù)方中藥植物添加劑采用大黃、苦參、白蒺藜、生黃精，合理配伍，相互協(xié)調(diào)，共奏去屑止癢之效。大黃，苦寒泄熱，去瘀血，蕩滌實(shí)熱積滯；苦參，清熱解毒、燥濕利尿、祛風(fēng)殺蟲；白蒺藜，祛風(fēng)止癢，行氣活血；生黃精，補(bǔ)腎益精，滋陰潤(rùn)煤，是多種復(fù)方滋補(bǔ)藥劑的重要組分，復(fù)方中藥合理配伍，共奏良效。

一、材料

1.受試中藥提取物

植物去屑組合物，購(gòu)白同仁堂國(guó)藥店。

陽性對(duì)照ZPT，購(gòu)自濱海明紅精細(xì)化工有限公司。

溶劑，乙醇，丙二醇，丁二醇，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2.菌種

糠枇馬拉色菌ATCC44344，購(gòu)自廣東微生物菌種保藏中心。

3.培養(yǎng)基

橄欖油培養(yǎng)基：蛋白胨10g，葡萄糖40g，酵母浸膏0.1g，單硬脂酸甘油酯2.5g，吐溫-802mL，橄欖油40mL，瓊脂18g，水1L。

4.儀器

RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SZCL-L型數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），TELSTAR mini-V/PCR型超凈工作臺(tái)（西班牙泰事達(dá)丁ELSTAR），SHP-150型生化培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器責(zé)任有限公司），LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）。

二、方法

1.植物去屑組合物提取液的制備

植物去屑組合物，粉碎，稱量10g植物去屑組合物粉末，裝入500mL三口圓底燒瓶中，加入適量提取溶劑，在恒溫水浴鍋中回流提取，粗過濾，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮去除乙醇，加丙二醇復(fù)溶至0.2g·mL^-1的植物去屑組合物提取液，滅菌保存，備用。

2.抑菌效果的測(cè)定

菌種的活化：菌種購(gòu)買來時(shí)均為裝入安瓿管中的凍干粉。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用75%的酒精擦洗安瓿管，然后用酒精燈灼燒安瓿管的頂端，接著迅速滴加無菌水使其冷卻，再用鑷子敲掉安瓿管頭部，用移液槍滴加0.1mL左右的液體培養(yǎng)基于安瓿管中，用手震蕩搖勻，此時(shí)安瓿管中菌種凍干粉為黏稠狀。接下來就可以用接菌環(huán)挑菌接入相對(duì)應(yīng)的平板和斜面上進(jìn)行活化，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

菌懸液的制備：取活化好的菌種若干，在無菌條件下，分別挑取一環(huán)已活化好的菌種放入9m L無菌水中震蕩搖勻、分級(jí)制成一系列菌懸液。麥?zhǔn)媳葷峁苤瞥删鷳乙簼舛葹?06cfu/mL。

抑菌實(shí)驗(yàn)（管碟法）：將預(yù)先熔化好、并滅菌處理過的培養(yǎng)基，輕輕搖勻后傾注平板，冷卻凝固，每個(gè)平板15mL左右。取馬拉色菌的菌懸液200μL于培養(yǎng)基中，均勻涂布，蓋好平皿，置室溫干燥5min。在每個(gè)培養(yǎng)皿上方均勻擺放3個(gè)牛津杯，3個(gè)牛津杯中每個(gè)注入260μL同種中藥提取液，作為3個(gè)平行，以無菌水為陰性對(duì)照，同時(shí)選用常用抗真菌劑ZPT做陽性對(duì)照。將培養(yǎng)皿放入35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，然后取出，觀察，拍照，用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。

體外抑菌定性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑小于8mm為不敏感（-），8～13mm為低度敏感（+），13～19mm為中度敏感（+），19mm以上為高度敏感（+++）。3次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用結(jié)果者，判為合格，陰性對(duì)照組無抑菌環(huán)產(chǎn)生，否則試驗(yàn)無效。

3.提取方法的選擇

分別用水浴提取、回流提取、超聲提取、微波提取、閃式提取5種提取方法提取植物去屑組合物中的功效成分，試驗(yàn)條件為：料液比1：10，提取溶劑70%乙醇，提取時(shí)間60min，提取溫度75℃。以糠秕馬拉色菌為公試菌株，采用管碟法對(duì)植物去屑組合物抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，通過比較5種提取方法對(duì)植物去屑組合物抑提取物的菌效果確定適合的提取方法。

4.提取溶劑的選擇

分別用水、乙醇、丙二醇、丁二醇4種提取溶劑提取植物去屑組合物中的功效成分，試驗(yàn)條件為：料液比1：10，提取時(shí)間60min，提取溫度75℃。采用管碟法對(duì)植物去屑組合物抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，通過比較4種溶劑提取對(duì)植物去屑組合物的抑菌效果確定適合的提取溶劑。

5.單因素試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)研究料液比、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)植物去屑組合物抑菌效果的影響。

1）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取物抑菌效果的影響

分別用乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、30%、50%、70%、90%回流提取植物去屑組合物中的功效成分，試驗(yàn)條件為：料液比1：10，提取時(shí)間60min，提取溫度75℃。采用管碟法對(duì)植物去屑組合物抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，確定適合的濃度。

2）提取時(shí)間對(duì)提取物抑菌效果的影響

分別按時(shí)間為0.5、1、1.5、2、3h回流提取植物去屑組合物中的功效成分，試驗(yàn)條件為：料液比1：10，提取溶劑70%乙醇，提取溫度75℃。采用管碟法對(duì)植物去屑組合物抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，確定適合的提取時(shí)間。

3）提取溫度對(duì)提取物抑菌效果的影響

分別在溫度為45、55、65、75、85℃的恒溫電熱加熱套中回流提取植物去屑組合物中的功效成分，試驗(yàn)條件為：料液比1：10，提取溶劑70%乙醇，提取時(shí)間60min。采用管碟法對(duì)植物去屑組合物抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，確定適合的提取溫度。

4）料液比對(duì)提取物抑菌效果的影響

分別按料液比為1：5、1：10、1：15、1：20、1：25回流提取植物去屑組合物中的功效成分，試驗(yàn)條件為：提取溶劑70%乙醇，提取時(shí)間60min，提取溫度75℃。采用管碟法對(duì)植物去屑組合物抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，確定適合的料液比。

6.提取工藝條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)，以料液比、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素、3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化植物去屑組合物抑菌成分的提取工藝，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

三、結(jié)果與分析

1.提取方法對(duì)植物去屑組合物抑菌效果的影響

考察5種提取方法對(duì)植物去屑組合物抑菌效果的影響，由表2可知，回流提取方法抑菌效果最好，因此確定回流提取為最終提取方法。

2.提取溶劑的選擇

考察4種提取溶劑對(duì)植物去屑組合物抑菌效果的影響，由表3可知，乙醇溶液提取物的抑菌效果最好，因此確定乙醇作為提取溶劑。

3.乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取物抑菌效果的影響

由圖3可知，隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的提高，抑菌圈增大，體積分?jǐn)?shù)在70%時(shí)抑菌效果最好。體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)，一些醇溶性雜質(zhì)成分溶出，干擾因素增多，導(dǎo)致抑菌效果下降。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇在70%較為適宜。

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，植物去屑組合物抑菌圈逐漸增大，但增加的幅度并不明顯，當(dāng)提取溫度為2h時(shí)提取物抑菌效果最好。提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，提取液抑菌效果降低。原因可能是長(zhǎng)時(shí)間的加熱提取提取破壞了部分抑菌活性物質(zhì)。因此，提取時(shí)間選擇在2h。

由圖5可以看出，隨著提取溫度的提高，抑菌圈增大，溫度在75℃時(shí)抑菌效果最好。溫度繼續(xù)增加時(shí)，抑菌活性下降，可能是高溫破壞了一些抑菌成分。因此提取溫度選擇在75℃較為適宜。

6.料液比對(duì)提取物抑菌效果的影響

由圖6可以看出，隨著料液比的增大，抑菌效果增加不明顯，在1：10～1：15時(shí)，抑菌效果最好。料液比繼續(xù)增大時(shí)，抑菌活性下降，原因可能是溶劑量增加，水溶性雜質(zhì)溶出率增加，導(dǎo)致抑菌效果下降。因此料液比選擇1：10～1：15較為適宜。

7.提取工藝條件的優(yōu)化

由表4極差R值可知，四個(gè)因素對(duì)抑菌率影響程度B>C>A>D，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>反應(yīng)時(shí)間>料液比>反應(yīng)溫度，由正交實(shí)驗(yàn)K值可知，最佳提取條件為ABCD，與正交表中最優(yōu)抑菌組合ABCD不相符，重復(fù)ABCD試驗(yàn)，抑菌圈直徑23.08mm，大于ABCD的21.87mm。因此植物去屑組合物抑菌成分最優(yōu)提取條件為ABCD，即料液比1：25，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間2h，提取溫度65℃。

由表5對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析可知，因素B即乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)結(jié)果有顯著性影響。

四、結(jié)論

乙醇回流提取植物去屑組合物中的活性成分，不僅提取工藝簡(jiǎn)單，而且容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。本實(shí)驗(yàn)研究探討了不同提取方法、提取溶劑、提取料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)植物去屑組合物抑菌效果的影響，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了植物去屑組合物抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件為：料液比1：25，70%乙醇，時(shí)間2h，溫度65℃。