趙 瑩，周國英，高月庭，楊 菁，李石磊

（中南林業(yè)科技大學 經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

油茶葉枯病拮抗放線菌GR54發(fā)酵條件的優(yōu)化

趙 瑩，周國英，高月庭，楊 菁，李石磊

（中南林業(yè)科技大學 經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

放線菌GR54對油茶葉枯病具有良好的拮抗效果。為對其進行開發(fā)利用，對其發(fā)酵條件的優(yōu)化進行研究，以達到對油茶主要病害的防治作用。研究不同發(fā)酵培養(yǎng)液、碳氮源等營養(yǎng)因子，以及培養(yǎng)時間、接種量、裝液量、初始pH值等非營養(yǎng)因子對放線菌發(fā)酵液抑菌活性的影響。綜合考慮菌體干重和對油茶葉枯病菌的抑菌率2個指標，生防放線菌的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)液為葡萄糖15 g、大豆粉10 g、NaCl 5 g、酵母膏1 g、CaCO31 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，接種量10%，裝液量100 mL，28℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。生防放線菌GR54的發(fā)酵培養(yǎng)液可有效抑制油茶葉枯病病原菌，抑制率可達93.05%。

油茶病害，拮抗放線菌，發(fā)酵條件，優(yōu)化

油茶Camellia oleifera Abel屬于山茶科，山茶屬，是我國南方重要的木本油料樹種，具有很高的經(jīng)濟價值[1]。但油茶病害目前已成為制約油茶產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的瓶頸[2]。近年來油茶葉枯病[3]Pestalotiopsis microspora發(fā)生嚴重，已上升為油茶主要病害，其導致果實和葉片脫落，嚴重影響油茶產(chǎn)量及質(zhì)量[4]。以往針對此病多是噴灑托布津等化學農(nóng)藥，效果不甚理想[5]，而且由于藥物殘留及污染環(huán)境等，化學防治已越來越受到限制。微生物農(nóng)藥是近年來農(nóng)藥發(fā)展的新方向，其以優(yōu)質(zhì)高效、低殘留、對環(huán)境友好安全等特點正逐步取代原有的化學農(nóng)藥，其中農(nóng)用抗生素作為生物農(nóng)藥的重要類群，以其低毒低殘留的特點備受重視[6-10]。然而，目前有關油茶葉枯病的生物防治方法研究較少，為此，本研究通過發(fā)酵培養(yǎng)從湖南攸縣油茶基地油茶林根際土壤中分離篩選的對葉枯病菌有良好拮抗效果的放線菌GR54，以達到對油茶葉枯病進行防治的目的，并為其進一步開發(fā)利用和工業(yè)化生產(chǎn)應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

拮抗菌株——放線菌GR54，分離篩選自油茶根際土壤。

指示菌株——油茶葉枯病菌（Pestalotiopsis microspora），由我校微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基[11]：高氏一號培養(yǎng)基，用于活化放線菌GR54；PDA培養(yǎng)基：用于病原菌的活化及抑菌活性的測定。

種子培養(yǎng)基：高氏一號液體培養(yǎng)基，用于放線菌GR54的種子液培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)液[11]：A（淀粉合成培養(yǎng)液）；B（葡萄糖黃豆粉酵母膏培養(yǎng)液）；C（葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液）；D（葡萄糖酵母膏培養(yǎng)液）；LB培養(yǎng)液；BPY培養(yǎng)液。用于初始發(fā)酵液篩選。

1.2 方 法

1.2.1 初始發(fā)酵培養(yǎng)液篩選

將拮抗放線菌GR54活化，用直徑6 mm的滅菌打孔器打成菌餅若干，在300 mL三角瓶中接入100 mL種子液，每瓶接種1個菌餅，28℃、160 r/min培養(yǎng)5 d，獲得發(fā)酵種子液。在編號為A、B、C、D、LB、BPY的300 mL三角瓶中各接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，再將10 mL種子液分別接種到六種供試發(fā)酵培養(yǎng)液中，28℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5d后取出菌絲體，30℃下烘干并稱量其菌體干重，每處理重復3次。同時取1 mL上述六種發(fā)酵液分別與已滅菌并冷卻至40℃左右的PDA培養(yǎng)基混勻制成平板，在平板中央接入已預先活化好的直徑6 mm的指示菌菌餅，以不加發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基為對照，在28℃下培養(yǎng)5 d，用十字交叉法[12]測量菌落直徑并計算抑菌率，每處理重復3次。以菌量最多和抑菌率最好的發(fā)酵培養(yǎng)液進行后續(xù)試驗。

菌絲生長抑制率=[（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/（對照菌落生長直徑-菌餅直徑）]×100%

1.2.2 液體發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)培養(yǎng)時間對菌株GR54生長與抑菌活性的影響 在300 mL三角瓶中接入1.2.1中篩選出的發(fā)酵培養(yǎng)液100 mL，再接入5 mL種子液，28℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)10 d。每天取出樣品一瓶，取菌絲體在30℃下烘干，稱量菌體干重；同時取發(fā)酵液1 mL與已滅菌并冷卻至40℃左右的PDA培養(yǎng)基混勻制成平板，在平板中央接入直徑6 mm的指示菌菌餅，以不加發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基為對照，28℃下培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測量菌落直徑并計算抑菌率，每處理重復3次。綜合考慮菌體干重和抑菌率以確定最佳培養(yǎng)時間。

(2)接種量對菌株GR54生長與抑菌活性的影響 在300 mL三角瓶中，將放線菌GR54種子液分別以體積分數(shù)2%、5%、7%、10%、13%、15%接種到1.2.1中篩選出的發(fā)酵培養(yǎng)液中，28℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d后，按1.2.2(1)中的方法確定最佳接種量。

(3)裝液量對菌株GR54生長與抑菌活性的影響 在300 mL三角瓶中分別裝入20 mL、40 mL、60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、150 mL篩 選出的發(fā)酵培養(yǎng)液，再以5%的體積分數(shù)接入種子液，按1.2.2(1)中的方法確定最佳裝液量。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件將兩組血壓控制情況、高血壓知識、技能掌握、年門診輸液或住院例次數(shù)情況進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示。兩組間比較采用t檢驗;組間前后比較采用配對t檢驗;率的比較用χ2檢驗。

(4)起始pH值對菌株GR54生長與抑菌活性的影響 先在300 mL三角瓶中裝入100 mL篩選出的發(fā)酵培養(yǎng)液，再分別用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將發(fā)酵培養(yǎng)液的pH值調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，再接入5 mL種子液，28℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)5 d，按1.2.2(1)中的方法確定最適起始pH值。

(5)不同碳源對菌株GR54生長與抑菌活性的影響 以1.2.1中篩選出的B發(fā)酵培養(yǎng)液為基礎，去掉其中的葡萄糖，再以2%的水平加入可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖，保持其他組分不變，配制成含有不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)液。再在其中加入5 mL種子液，28℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)5 d，按1.2.2(1)中的方法確定最佳碳源。

(6)不同氮源對菌株GR54生長與抑菌活性的影響 以1.2.1中篩選出的B發(fā)酵培養(yǎng)液為基礎，去掉其中的大豆粉，再以2%的水平加入酵母膏、蛋白胨、大豆粉、(NH4)2SO4、NH4NO3，保持其他組分不變，配制成含有不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)液。再在其中加入5 mL種子液，28℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)5 d，按1.2.2(1)中的方法確定最佳氮源。

(7)碳氮源的優(yōu)化對菌株GR54生長與抑菌活性的影響 選擇不同的碳、氮源濃度進行3因素3水平的正交實驗。利用正交表L933（3因素 3水平）安排實驗，28℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)5 d，按1.2.2(1)中的方法確定最佳碳、氮源優(yōu)化組合。

表1 主要培養(yǎng)參數(shù)L933正交設計Table 1 Orthogonal design of main cultivate parameters

2 結(jié)果與分析

2.1 初始發(fā)酵培養(yǎng)液的篩選

初始發(fā)酵培養(yǎng)液的篩選結(jié)果見圖1。由圖可知，在6種供試培養(yǎng)液中，菌株GR54在B發(fā)酵培養(yǎng)液中菌體干重最大，達1.334 2 g，其次為C發(fā)酵培養(yǎng)液(1.276 1 g)；從抑菌率看，菌株CF17在B發(fā)酵培養(yǎng)液中抑菌率最大，可達93.05%，其次為C發(fā)酵培養(yǎng)液（91.56%），因此選用B發(fā)酵培養(yǎng)液進行后續(xù)試驗。

圖1 不同培養(yǎng)基對菌體生長及抑菌活性的影響Fig.1 Effects of different media on cell growth and antimicrobial activity

2.2 液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)時間對菌株GR54生長與抑菌活性的影響

2.2.2 接種量對菌株GR54生長與抑菌活性的影響

不同接種量對菌株GR54生長的影響見圖3。由圖可知，菌株生長隨接種量比例的增加呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢，菌體干重在接種量為10%時達到最高值（1.593 6 g），抑菌率也在接種量為10%時達到最大值（94.23%），故最佳接種量選為10%。

圖2 培養(yǎng)時間對菌體生長及抑菌活性的影響Fig.2 Effects of different culture time on cell growth and antimicrobial acrivity

圖3 不同接種量對菌體生長及抑菌活性的影響Fig.3 Effect of different inoculum size to cell growth and antimicrobial activity

2.2.3 裝液量對菌株GR54生長與抑菌活性的影響

不同裝液量對菌株GR54生長的影響見圖4。由圖可知，菌株的生長隨裝液量的增加大致呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在裝液量為100 mL時菌體干重達最大（1.105 4 g）；同時抑菌率在裝液量為100 mL時達最大（90.12%），其他裝液量情況下變化不大。故最佳裝液量選為100 mL。

圖4 不同裝液量對菌體生長及抑菌活性的影響Fig.4 Effect of different liquid volume in fl ask on cell growth and antimicrobial activity

2.2.4 起始pH值對菌株GR54生長與抑菌活性的影響

不同起始pH值對菌株GR54生長的影響見圖5。由圖可知，菌株的生長隨pH值的升高呈先上升后下降的趨勢，在pH值為7時菌體干重達最大值（1.124 8 g）；pH值在4～7范圍內(nèi)抑菌率逐漸升高，在7～9范圍內(nèi)抑菌率逐漸降低，在pH值為7時抑菌率達最大值（89.63%），在低于4和高于9時，抑菌率較低。故最佳起始pH值為7。

圖5 不同pH值對菌體生長及抑菌活性的影響Fig.5 Effects of different pH on cell growth and antimicrobial activity

2.2.5 不同碳源對菌株GR54生長與抑菌活性的影響

不同碳源對菌株GR54生長的影響見圖6。由圖可知，以葡萄糖作為碳源時，菌株GR54的菌體干重最大，為1.624 2 g，其次為蔗糖和可溶性淀粉。抑菌率方面，當葡萄糖為碳源時，抑菌率可達93.28%，其次為可溶性淀粉和蔗糖。故最佳碳源為葡萄糖。

圖6 不同碳源對菌體生長及抑菌活性的影響Fig.6 Effects of different carbon sources on cell growth and antimicrobial activity

2.2.6 不同氮源對菌株GR54生長與抑菌活性的影響

不同氮源對菌株GR54生長的影響見圖7。由圖可知，以大豆粉為氮源時，菌體干重達最大值，為1.434 2 g，其次為酵母膏和蛋白胨。抑菌率方面，以大豆粉為氮源時，其抑菌率可達94.05%，其次為蛋白胨和NH4NO3，故最佳氮源為大豆粉。

圖7 不同氮源對菌體生長及抑菌活性的影響Fig.7 Effects of different nitrogen sources on cell growth and antimicrobial activity

2.2.7 碳氮源的優(yōu)化對菌株GR54生長與抑菌活性的影響

碳源選用葡萄糖，氮源選用大豆粉和酵母膏，進行3因素3水平的正交實驗，實驗結(jié)果見表2。

表2 碳氮源正交實驗Table 2 Results of orthogonal experiment of carbon and nitrogen sources

根據(jù)這18組碳氮源正交實驗結(jié)果表明，在不同的碳氮源配比條件下，菌株GR54的生長和抑菌活性均能達到較高的水平，抑菌率均可達80%以上。綜合考慮最終選擇以1.5%葡萄糖和1.0%大豆粉作為最佳碳氮比，在此條件下，菌體干重為1.589 g，抑菌率為96.8%。

3 結(jié)論與討論

菌株發(fā)酵是一個非常復雜的過程，其中會受到很多因素的影響。本研究以菌體干重和抑菌率為主要衡量指標，對放線菌GR54的發(fā)酵條件進行了研究，最終確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)液為葡萄糖15 g、大豆粉10 g、NaCl 5 g、酵母膏1 g、CaCO31 g、蒸餾水1 000 mL。其中大豆粉營養(yǎng)均衡，蛋白質(zhì)水解緩慢，前期可控制菌株的生長速度，不致過快而導致后勁不足，菌體過早衰老，且大豆粉含有豐富的有機氮，利于菌株吸收，并且廉價易得。而葡萄糖是最易吸收利用的碳源，適量添加有利于菌株生長，但過量添加會加速菌體呼吸而導致發(fā)酵液中溶解氧不足，因此通過正交實驗最終確定葡萄糖添加量為1.5%。本研究發(fā)現(xiàn)當發(fā)酵液中存在天然碳、氮源時，會大大增加菌株的生長量，并能夠在一定程度上反映抑菌活性，這與曹廣麗等[13]、崔晉龍等[14]、許靈波等[15]的研究結(jié)果相一致。對菌株培養(yǎng)時間的研究發(fā)現(xiàn)，放線菌GR54在培養(yǎng)第5天時菌體干重達到最大值，而在培養(yǎng)第7天時抑菌率達到最大值，間隔為2 d，即菌株先生長再產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，這是因為大部分抗菌物質(zhì)是菌株在生長過程中分泌的次級代謝產(chǎn)物，這與前人的實驗結(jié)果相一致[14-16]。最佳發(fā)酵條件需保持一定的接種量與裝液量，過低的接種量會導致培養(yǎng)液利用不完全，造成浪費，也會使菌株產(chǎn)量過低，無法達到較好的抑菌效果；反之則會導致菌株迅速生長，培養(yǎng)液大量消耗，造成后期生長緩慢，抑菌物質(zhì)產(chǎn)量低。裝液量過低會導致菌株可利用營養(yǎng)物質(zhì)過少，抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量低；過高則會導致發(fā)酵液中氧含量低，不利于菌株生長。同時在發(fā)酵液中加入了可有效調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值的

CaCO3，以及可在菌株合成代謝過程中充當調(diào)節(jié)物的無機鹽NaCl，此外，若適量添加微量元素，抗生素的產(chǎn)量有望更高[17-20]。本研究為利用放線菌

GR54防治油茶葉枯病奠定了基礎，并為進一步進行發(fā)酵罐培養(yǎng)提供了理論依據(jù)，但其實際防效以及對病原菌的持續(xù)控制作用仍需通過進一步的盆栽試驗及田間防效實驗加以完善。

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Optimization of fermentation conditions of actinomycete GR54 against Camellia oleifera leaf blight

ZHAO Ying, ZHOU Guo-ying, GAO Yue-ting, YANG Jing, LI Shi-lei
(Key Laboratory for Non-timber Product Forest Silviculture and Protection of Ministry of Education, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Actinomycete GR54 has a good ability against Camellia oleifera leaf blight. A lots of researches on the optimization of culture fermentation conditions of actinomycete GR54 against Camellia oleifera leaf blight were conducted in order to control the disease. The effects of trophic factors (different fermentation culture solution, carbon and nitrogen sources) and non-trophic factors (incubation time,inoculum size, loaded liquid and initial pH value) on the antibacterial activity of the fermentation broth were investigated. By take two factors(mycelium dry weight and rate of inhibiting bacteria ) into consideration, the best cultural solution formula consisted of glucose 15 g, soybean meal 10 g, NaCl 5 g, yeast extract 1g, CaCO31g, distilled water 1 000 mL, pH7.0, inoculum size 10%, loaded liquid 100 mL, 28℃, 160 r/min shaking cultivation for 7 days. The fermentation broth of the GR54 can effectively inhibit the pathogenic bacteria of Camilla oleifera leaf blight with an inhibitory rate of 93.05%.

Camellia oleifera disease; antagonism actinomycetes; fermentation conditions; optimization

S794.4；S763.1

A

1673-923X(2013)07-0081-05

2012-10-16

國家“十二五”科技計劃課題（2012BAD19B0803）

趙 瑩（1986-），女，遼寧丹東人，碩士研究生，主要從事微生物學研究

周國英（1966-），女，湖北應城人，博士 , 教授，博士生導師，主要從事森林保護、微生物學教學及研究

[本文編校：吳 毅]