劉立民，劉美，朱旭，孫亞欣，何曉靜，邱楓，肇麗梅 （中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽110004）

拉莫三嗪（lamotrigine，LTG）是一種新型的苯基三嗪類抗癲癇藥物，臨床主要用于難治性癲癇局部發(fā)作或全身發(fā)作的添加治療或單藥治療。有研究表明，LTG 所致的不良反應(yīng)發(fā)生率與LTG 血藥濃度升高密切相關(guān)［1］，LTG 的有效治療濃度范圍建議為1～4μg·mL－1［2－4］，但是年齡、合并用藥等多種因素影響LTG 血藥濃度［5］，因此在臨床工作中有必要監(jiān)測LTG 血藥濃度。LTG 與丙戊酸鈉合用在癲癇治療中較為常見，而且有研究表明丙戊酸鈉會抑制LTG 代謝，使LTG 血 藥 濃 度 升 高［6］，因 此 建 立測定人血漿中LTG 濃度反相高效液相色譜法的基礎(chǔ)上，對25名同時使用丙戊酸鈉及LTG 的癲癇患者的LTG 血藥濃度進(jìn)行了監(jiān)測，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent－1100 系列高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；GL－20G－Ⅱ高速低溫離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HY－4調(diào)速多用振蕩器（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）；XW－80A 渦旋混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑 LTG 對照品（批號100775－200401，規(guī)格：100mg，純度＞98%）；氯唑沙宗對照品（批 號100364－200301，規(guī) 格：50 mg，純 度＞98%）；空白血漿由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院輸血科提供，乙腈、甲醇為色譜純，磷酸二氫鈉、乙醚均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色 譜 條 件 色 譜 柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈－0.05 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液（v／v，26.5∶73.5，pH 4.5）；柱溫：25 ℃；流速：1.0mL·min－1；檢測波長：220nm。在該色譜條件下LTG 與氯唑沙宗分離良好，保留時間分別為3.3min 和10.9 min，血 漿 中 內(nèi) 源 性 物 質(zhì) 不 干 擾LTG 測定，見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密量取LTG 對照品10 mg，加甲醇溶解并定容至10mL 量瓶中，得1.0mg·mL－1的LTG 儲備液。將LTG 儲備液用甲醇稀釋，配 制 為2.0，4.0，16.0，32.0，64.0，80.0，120.0 μg·mL－1的LTG 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲備液及標(biāo)準(zhǔn)溶液于4 ℃下保存。

圖1 拉莫三嗪血漿樣品色譜圖A.空白血漿；B.添加標(biāo)準(zhǔn)品的空白血漿；C.患者服藥后拉莫三嗪血漿樣品；1－拉莫三嗪；2－氯唑沙宗Fig 1 HPLC chromatograms of lamotrigine in plasmaA.blank plasma；B.blank plasma＋lamotrigine control；C.plasma sample after taking medication；1－Lamotrigine；2－Chlorzoxazone

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取氯唑沙宗對照品8mg，溶解于甲醇并定容至10 mL。取1.0 mL，用甲醇稀釋并定容至10mL，得80μg·mL－1的氯唑沙宗內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 血漿樣品處理及測定 精密吸取血漿樣品200μL，置于10mL玻璃試管中，加入甲醇50μL，內(nèi)標(biāo)溶液50μL，旋渦混勻后加入乙醚3mL，振蕩20min，3 500r·min－1離心8min，取上清液，40 ℃水浴下空氣吹干，200μL甲醇－水（3∶2）溶解，渦旋1 min混勻，10 800r·min－1離心5 min，取10μL 進(jìn)樣，進(jìn)行分析。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取空白血漿200μL，加入不同濃度的LTG標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL，配成質(zhì)量濃度為0.5，1.0，4.0，8.0，16.0，20.0，30.0μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)系列血漿樣品，按“2.4”項下方法操作，分別測定LTG 和內(nèi)標(biāo)的峰面積，以LTG 和內(nèi)標(biāo)的峰面積AS／Ai之比為縱坐標(biāo)，LTG濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：As／Ai＝0.095 6C＋0.002 3（r＝0.991 1）。結(jié) 果表明LTG在0.5～30.0μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。LTG的定量下限為0.5μg·mL－1。

2.6 精密度與回收率試驗 取200μL 空白血漿，分別加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的LTG 標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL，渦旋混勻，使血藥質(zhì)量濃度分別相當(dāng)于1.0，8.0，20.0μg·mL－1。按“2.4”項下方法處理并測定。以測得值與加入值之比計算方法回收率。另取空白血漿200μL，除不加標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)外按“2.4”項下操作，向提取后的空白血漿樣品中加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的LTG 標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL和內(nèi)標(biāo)溶液50μL，渦旋混合，進(jìn)行分析獲得相應(yīng)峰面積，以每一濃度2種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。以一天內(nèi)測得的LTG 濃度計算日內(nèi)精密度，以一周內(nèi)5 次測定的LTG 濃度計算日間精密度。結(jié)果見表1。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery and precision test

2.7 穩(wěn)定性試驗 按“2.4”項下方法分別配制1.0，8.0，20.0μg·mL－13種質(zhì)量濃度的LTG 血漿質(zhì)控樣品各3份，分別在室溫下放置17h，4 ℃放置24 h，－20 ℃冰凍放置1個月，測定樣品濃度，結(jié)果相對誤差（RE%）均小于15%，表明樣品在上述條件下是穩(wěn)定的。

2.8 其他藥物干擾性試驗 根據(jù)臨床常用治療方案，考察了地西泮、氯丙嗪、苯巴比妥、巴比妥及丙戊酸對色譜圖的干擾。取空白血漿200μL，共10份，加入LTG 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成質(zhì)量濃度為8.0μg·mL－1，分別加入 地 西泮（2.0μg·mL－1）、氯丙嗪（100.0μg·mL－1）、苯巴比妥（100.0μg·mL－1）、巴比妥（100.0μg·mL－1）、丙戊酸（100.0μg·mL－1），按“2.4”項下操作。結(jié)果顯示，在本實驗色譜條件下地西泮與丙戊酸無吸收峰，其余各藥物與LTG 及內(nèi)標(biāo)分離良好，見圖2。

圖2 含其他抗癲癇藥物的色譜圖1－拉莫三嗪；2－氯唑沙宗；3－氯丙嗪；4－苯巴比妥；5－巴比妥Fig 2 HPLC chromatograms of lamotrigine with other AEDs in plasma1－lamotrigine；2－chlorzoxazone；3－chlorpromazine；4－phenobarbital；5－barbital

2.9 血藥濃度測定 收集25例同時服用丙戊酸鈉與拉莫三嗪并達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度的癲癇患者的血樣，按“2.4”項下方法操作，測定。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾LTG 的測定，血藥質(zhì)量濃度范圍為0.5～10.2μg·mL－1，日劑量在0.5～3.8mg·kg－1·d－1范圍內(nèi)，使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對日劑量及LTG 血藥濃度進(jìn)行相關(guān)性分析，P＝0.000，P＜0.05，二者具有線性關(guān)系，見圖3。

圖3 LTG 血藥濃度與劑量的關(guān)系Fig 3 The relationship between LTG concentration and daily doses of LTG

3 討論

3.1 實驗方法的選擇 在文獻(xiàn)報道中，選用的內(nèi)標(biāo)有氯硝西泮、艾司唑侖、乙酰苯胺、萘普生［7－10］，但在本實驗條件下，上述內(nèi)標(biāo)與LTG 不能很好分離。因此嘗試性地使用了非那西丁和氯唑沙宗作為內(nèi)標(biāo)，其中LTG 與氯唑沙宗的分離度良好，同時與其他常用抗癲癇藥物分離良好，因此選擇了氯唑沙宗作為內(nèi)標(biāo)。

本實驗嘗試使用乙酸乙酯、二氯甲烷作為提取劑，前者揮發(fā)緩慢，不易吹干，后者回收率不穩(wěn)定，而乙醚極易揮發(fā)，而且回收率高而穩(wěn)定，所以選擇了乙醚作為提取劑。同時LTG 不易被氧化，空氣吹干即可，速度快，節(jié)約成本。

3.2 干擾性藥物的選擇 拉莫三嗪不僅可用于癲癇的添加治療，還可用于精神分裂癥的輔助治療［11］，因此選擇了常用抗癲癇藥物地西泮、苯巴比妥、巴比妥、丙戊酸及常用抗精神分裂癥藥物氯丙嗪來考察其干擾性。

3.3 患者血藥濃度結(jié)果分析 25 名癲癇患者的LTG 劑量范圍介于0.5～3.8mg·kg－1·d－1之間，與文獻(xiàn)報道的聯(lián)合丙戊酸時拉莫三嗪的推薦劑量1～3mg·kg－1·d－1［12］基本一致。按照標(biāo)準(zhǔn)化血藥濃度（測定濃度／（日劑量／體質(zhì)量））將25名患者的血藥濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其質(zhì)量濃度范圍為0.8～5.1μg·mL－1，多數(shù)質(zhì)量濃度介于1～4μg·mL－1間，與文獻(xiàn)報道的（3.41±1.18）μg·mL－1［13］基本一致，但是有個別患者例外。劑量－濃度相關(guān)性分析結(jié)果表明，LTG 血藥濃度與日劑量存在線性相關(guān)，但在相同給藥劑量時，血藥濃度有較大波動。波動可能與下列因素有關(guān)：（1）藥物代謝存在個體差異性，LTG 主要通過UGT1A4，2B7 代謝，有研究認(rèn)為UGT1A4（142T＞G）和UGT2B7（－161C＞T）的基因多態(tài)性影響LTG 血藥濃度［14－15］；（2）25名癲癇患者均同時使用了丙戊酸鈉，藥物相互作用是不可忽視的因素［16］。丙戊酸與LTG 同為UGT2B7的底物，丙戊酸抑制由UGT2B7 催化的LTG 葡萄糖醛酸化反應(yīng)［17］。通過進(jìn)一步衡量25名患者的年齡、肝功能、LTG 標(biāo)化給藥量，篩選出基本情況無差異但VPA標(biāo)化給藥量有差異的患者共3組（每組各2例），3組均顯示出LTG 濃度隨VPA 標(biāo)化給藥量的增加而增加的特點，提示LTG 血藥濃度與VPA 用量有關(guān)。當(dāng)LTG 與VPA 聯(lián)合使用時，尤其是VPA 用量較大時，需關(guān)注二者的藥物相互作用，有必要對LTG 血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測，制定合理的給藥方案。

本試驗建立了RP－HPLC 測定LTG 血藥濃度的方法，初步測定了合并VPA 時LTG 的血藥濃度范圍，不足之處是樣本量偏小，需擴大樣本量并設(shè)立對照組以進(jìn)一步說明VPA 對LTG 的影響程度等相關(guān)問題。

［1］ Hirsch LJ，Weintraub D，Du Y，et al.Correlating lamotrigine serum concentrations with tolerability in patients with epilepsy［J］.Neurology，2004，63：1022－1026.

［2］ Bartoli A，Guerrini R，Belmonte A，et al.The influence of dosage，age，and comedication on steady state plasma lamotrigine concentrations in epileptic children：a prospective study with preliminary assessment of correlations with clinical response［J］.Ther Drug Monit，1997，19（3）：252－260.

［3］ Pellock JM.The clinical efficacy of lamotrigine as an antiepileptic drug［J］.Neurology，1994，44（11，Suppl.8）：29－35.

［4］ Brodie MJ，Richens A，Yuen AW.Double－blind comparison of lamotrigine and carbamazepine in newly diagnosed epilepsy［J］.Lancet，1995，345（8948）：476－479.

［5］ May TW，Rambeck B，Jurgens U.Serum concentrations of lamotrigine in epileptic patients：the influence of dose and comedication［J］.Ther Drug Monit，1996，18：523－531

［6］ Gidal BE，Anderson GD，Lanning A，et al.Lack of effect of VPA concentration on lamotrigine pharmacokinetics in developmentally disabled patients with epilepsy［J］.Epilepsy Res，2000，42（1）：23－31.

［7］ 陳小陸，任斌，肖力，等.HPLC測定拉莫三嗪血藥濃度［J］.中國藥學(xué)雜志，2008，43（3）：232－233.

［8］ 李琪，雷力力，張志國，等.HPLC法測定人血漿中的拉莫三嗪［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，34（6）：39－40.

［9］ 杜軍，李憶軍.RP－HPLC測定拉莫三嗪和苯巴比妥的血藥濃度［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，7（8）：39－41.

［10］錢方，王玉亮，劉皋林，等.RP－HPLC法測定拉莫三嗪的血藥濃度及應(yīng)用［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，21（10）：999－1000.

［11］徐西嘉，趙靖平.拉莫三嗪輔助治療精神分裂癥［J］.臨床精神醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（1）：61－62.

［12］Duchowny M，Pellock JM，Graf WD，et al.A placebo－controlled trial of lamotrigine add－on therapy for partial seizures in children［J］.Neurology，1999，53：1724－1731.

［13］Armijo JA，Bravo J，Cuadrado A，et al.Lamotrigine serum concentration－to－dose ratio：influence of age and concomitant antiepileptic drugs and dosage implications［J］.Ther Drug Monit，1999，21（2）：182－190.

［14］Gulcebi MI，Ozkaynakci A，Goren MZ，et al.The relationship between UGT1A4polymorphism and serum concentration of lamotrigine in patients with epilepsy［J］.Epilepsy Research，2011，95：1－8.

［15］Maria BS，Jose L，Carlos L，et al.UGT2B7＿－161C＞T polymorphism is Aassociated with lamotrigine concentration－todose ratio in a multivariate study［J］.Ther Drug Monit，2010，32：177－184.

［16］Battino D，Croci D，Granata T，et al.Single－dose pharmacokinetics of lamotrigine in children：influence of age and antiepileptic comedication［J］.Ther Drug Monit，2001，23：217－222.

［17］Rowland A，Elliot DJ，Williams JA，et al.In vitro characterization of lamotrigine N2－glucuronidation and the lamotriginevalproic acid interaction［J］.Drug Metab Dispos，2006，34（6）：1055－1062.