李冰，王浩，洪浩 （.安慶市立醫(yī)院，安徽 安慶46003；.中國藥科大學藥理教研室，江蘇 南京0009）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種以認知記憶功能進行性減退為主要臨床表現(xiàn)的一種致死性神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積和腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)缺失［1－2］。AD發(fā)病率隨著人類現(xiàn)代化和老年化進程的加速而逐年攀升，并且有不斷年輕化的趨勢，給家庭和社會面帶來沉重的負擔。目前臨床上治療藥物的種類和療效十分有限，而市場需求逐年增加［2］。因此，尋找更有效的防治AD的藥物具有重要意義。替米沙坦是1型血管緊張素Ⅱ受體（AT1R）拮抗劑，臨床上常用于治療高血壓病。近些年來，文獻不斷報道，AT1R 拮抗劑如纈沙坦、氯沙坦、替米沙坦等可顯著改善轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠或Aβ誘導的癡呆模型動物學習記憶損害［3］，但AT1R拮抗劑是否可以通過提高中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能改善學習記憶損害目前尚未見文獻報道。本研究采用東莨菪堿誘導的癡呆模型，探究替米沙坦對對東莨菪堿模型小鼠學習記憶及腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)的影響，為進一步研究AT1R拮抗劑防治AD奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Morris水迷宮（上海吉量軟件科技有限公司）；MG－3S型Y 迷宮刺激器（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；16／18 型紫外／可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）。

1.2 藥物與試劑 鹽酸替米沙坦（telmisartan，Tel，江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司，批號1105012）；東莨膽堿注射液（scopolamine，Sco，上海禾豐制藥有限公司，批號120503）；鹽酸多奈哌齊（安理申，aricept，Ari，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號110208A）；羧甲基纖維素鈉（CMC－Na，國藥集團化學試劑有限公司，批號20091221）；乙酰膽堿試劑盒、乙酰膽堿酯酶試劑盒及考馬斯亮藍試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗動物 ICR 小鼠，雄性，清潔級，體質(zhì)量（20±2）g，共40只，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（蘇）2007－0001。

2 方法

2.1 分組、模型建立及給藥 取清潔級ICR 小鼠40只，體質(zhì)量18～22g，按體質(zhì)量隨機分為5組，即Sal＋Veh組、Sco＋Veh組、Sco＋Ari組、Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）組、Sco＋Tel（0.35 mg·kg－1）組，每組8只。

Sco＋Veh組、Sco＋Ari組、Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）組、Sco＋Tel（0.35mg·kg－1）組腹腔注射東莨菪堿（Sco，1.0mg·kg－1），Sal＋Veh組腹腔注射等體積的生理鹽水（Sal）。30min后灌胃給藥，Sco＋Ari組灌胃給予安理申（Ari，2mg·kg－1），Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）組和Sal＋Tel（0.35mg·kg－1）組灌胃給予替米沙坦，Sal＋Veh組和Sco＋Veh組給予等體積的0.5% CMC－Na。腹腔注射和灌胃給藥均每天1次，連續(xù)17d。

2.2 Morris水迷宮試驗 給藥第8天進行Morris水迷宮試驗，為期6d，第1，2天為可見平臺訓練，第3，4，5天為隱藏平臺訓練，第6天為空間搜索試驗。水迷宮試驗期間每天繼續(xù)給藥，于灌胃給藥30min后進行試驗。（1）可見平臺訓練：將插有旗子的水迷宮平臺（旗子高于平臺5cm）置于水迷宮第4象限，放入25 ℃左右水至沒過平臺5mm。每天從1，2，3，4四個象限（4個入水點）分別將小鼠面向池壁放入水中，使其自由游泳90s，90s內(nèi)小鼠找到平臺并上臺停留10s后將其從平臺上取下休息，計算機監(jiān)測并記錄小鼠從入水開始至爬上平臺所需的時間（潛伏期）及穿越平臺的次數(shù)等數(shù)據(jù)。若90s內(nèi)動物未找到平臺，則將小鼠引到平臺，并停留30s，潛伏期記為90s。（2）隱藏平臺訓練：將未插有旗子的水迷宮平臺置于水迷宮第4象限，放入25℃左右水至沒過平臺5 mm。訓練方法同可見平臺訓練。（3）空間搜索試驗：試驗第6天撤除平臺，任選一象限將各組小鼠依次從該象限面向池壁放入水中，使其自由游泳90s，記錄小鼠在第4象限停留的時間占總時間的百分比（行為學測試過程中應保持光線柔和，房間安靜，各參照物位置不變）。

2.3 Y 迷宮試驗 Morris水迷宮試驗后進行Y 迷宮試驗，Y 迷宮電壓設(shè)置10V，電擊延遲時間為2 s，試驗為期2d，第1天為訓練，首先將小鼠放入Y迷宮，適應環(huán)境5min，然后將小鼠置于某一臂作為起點區(qū)，進行電擊，其一次逃至安全區(qū)為正確反應，否則記為錯誤反應。電擊每次間隔30s，依次重復，連續(xù)訓練10 次。第2 天為測試，此次無需適應5 min，實驗操作和方法同第1天，記錄小鼠在連續(xù)10次電擊中的正確逃避次數(shù)。

2.4 小鼠腦組織海馬區(qū)和皮層區(qū)乙酰膽堿（ACh）及乙酰膽堿酯酶（AChE）含量測定 將小鼠斷頭取腦，用預冷生理鹽水沖洗表面血液，分離海馬和皮層，取一部分樣本以質(zhì)量／體積比1∶9加入裂解液，制成約10%勻漿，3 500r·min－1、4 ℃離心15min，取上清液，按試劑盒說明規(guī)定的方法測定ACh 含量。另一部分樣品以質(zhì)量／體積比1∶9加入4 ℃生理鹽水，制成約10%的勻漿，3 500r·min－1、4 ℃離心15min，取上清液，按試劑盒說明規(guī)定的方法測定AChE含量。并用考馬斯亮藍定量蛋白。

3 結(jié)果

3.1 Morris水迷宮試驗 在可見平臺訓練中，各組小鼠的訓練潛伏期無顯著差異（P＞0.05，n＝8），見圖1，說明各組小鼠對目標的識別能力和色覺均正常。在隱藏平臺試驗中，試驗第2 天，Sal＋Veh組和Sco＋Ari組潛伏期均小于Sco＋Veh組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，n＝8），試驗第3 天，Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）組和Sco＋Tel（0.35mg·kg－1）組小鼠的潛伏期均小于Sco＋Veh 組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，n＝8），見圖2。在空間探索試驗中，Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）組和Sco＋Tel（0.35mg·kg－1）組小鼠在原平臺所在象限停留時間百分率及穿越平臺次數(shù)均顯著大于Sco＋Veh組（P＜0.05，P＜0.01，n＝8），見圖3～5。

3.2 Y 迷宮試驗 如圖2所示，Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）組和Sco＋Tel（0.35 mg·kg－1）組較Sco＋Veh組正確反應次數(shù)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01，n＝8），見圖6。

Morris水迷宮和Y 迷宮試驗結(jié)果提示，替米沙坦（0.35～0.70 mg·kg－1）對東莨菪堿模型小鼠學習記憶損害有顯著改善作用。

3.3 替米沙坦對東莨菪堿模型小鼠腦內(nèi)乙酰膽堿（ACh）及乙酰膽堿酯酶（AChE）的影響 與Sco＋Veh組比較，Sco＋Tel（0.70mg·kg－1）組和Sco＋Tel（0.35mg·kg－1）組小鼠腦組織海馬區(qū)和皮層區(qū)ACh含量顯著增多（P＜0.05，P＜0.01，n＝4），而AChE活力顯著下降（P＜0.05，n＝4）（表1），提示，替米沙坦可抑制東莨菪堿模型小鼠腦內(nèi)AChE 活性，提高ACh含量。

表1 各組小鼠海馬及皮層ACh及AChE含量比較（U·mgprot－1，±s，n＝4）Tab 1 Comparison of the ACh and AChE content in mice’s hippocampus and cortex of each group（U·mgprot－1，±s，n＝4）

表1 各組小鼠海馬及皮層ACh及AChE含量比較（U·mgprot－1，±s，n＝4）Tab 1 Comparison of the ACh and AChE content in mice’s hippocampus and cortex of each group（U·mgprot－1，±s，n＝4）

注：A.Sal＋Veh；B.Sco＋Veh；C.Sco＋Ari／2 mg·kg－1；D.Sco＋Tel／0.70mg·kg－1；E.Sco＋Tel／0.35mg·kg－1。與Sco＋Veh組比較，aP＜0.05，b P＜0.01

4 討論

基底前腦膽堿能神經(jīng)元退變、丟失是AD 患者學習記憶損害的主要原因之一，ACh及其受體在調(diào)節(jié)學習記憶活動中發(fā)揮著十分重要的作用。提高ACh及其受體功能的藥物如膽堿酯酶抑制劑（多奈哌齊、利斯的明等）是目前臨床上治療AD 的一類重要藥物［2］。東莨菪堿為非選擇性M 受體阻斷劑，可以通過血腦屏障進入中樞，阻斷中樞ACh與其受體的結(jié)合，破壞大腦皮層和海馬等部位的膽堿能神經(jīng)信號傳遞，使學習記憶功能下降［4］。東莨菪堿用于誘導動物記憶損害模型具有簡單、經(jīng)濟、方便等優(yōu)點，故常應用于抗AD 活性化合物的初步篩選［5］。AT1R 拮抗劑替米沙坦脂溶性較高，較其他AT1R拮抗劑更易通過血腦屏障［6］。值得注意的是，我們使用的替米沙坦劑量非常低（0.35～0.70mg·kg－1·d－1），僅相當于抗高血壓劑量的1／60～1／30，因此，替米沙坦改善東莨菪堿模型小鼠學習記憶損害的同時不影響血壓［6－8］。本研究發(fā)現(xiàn)，替米沙坦通過降低AChE活性提高膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)ACh含量，改善東莨菪堿模型小鼠學習記憶損害。替米沙坦是怎樣降低AChE 活性尚不清楚，有可能直接抑制AChE活性，也有可能通過阻斷AT1R 下調(diào)AChE表達。此外，替米沙坦還是一個PPARγ部分激動劑。激活PPARγ也可能是替米沙坦改善東莨菪堿模型小鼠學習記憶損害機制之一［5］。

［1］ 張勤安，高曉群.阿爾茨海默病發(fā)病機制研究進展［J］.醫(yī)學研究雜志，2012，41（2）：7－9.

［2］ 楊文超 孫琦 喻寧熙，等.治療阿爾茨海默病的乙酰膽堿酯酶抑制劑的分子設(shè)計：從多位點抑制劑到一藥多靶［J］.藥學學報，2012，47（3）：313－321.

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