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        南方紅豆杉內(nèi)生真菌的分離鑒定及其細(xì)胞毒活性研究

        2013-12-23 05:45:38張慶波陳玉嬋李浩華潘清靈王磊李冬利陶美華章衛(wèi)民
        生物技術(shù)通報(bào) 2013年1期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞毒粗提物紅豆杉

        張慶波 陳玉嬋 李浩華 潘清靈 王磊 李冬利 陶美華 章衛(wèi)民

        (1. 廣東省微生物研究所 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室 廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,廣州 510070;2. 中國科學(xué)院南海海洋研究所,廣州 510301)

        南方紅豆杉(Taxus chinensis var. mairei Cheng et L.K)為紅豆杉屬(Taxus Linn)植物,主要分布于長江流域、南嶺山脈山區(qū)及河南、陜西(秦嶺)、甘肅等省。自紅豆杉中發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特抗癌機(jī)制的紫杉醇后,人們開始大量從紅豆杉樹皮中提取紫杉醇,致使紅豆杉資源遭到嚴(yán)重破壞。為解決紫杉醇的新來源,人們采用了各種不同的方法,并取得了一定的成果。1991年,Christen等通過太平洋紅豆杉(Taxus brevifolia)的組織培養(yǎng)獲得了紫杉醇[1];1994年,Nicolaou等[2]完成了紫杉醇的全合成。1993年,Stierle等[3]從太平洋紅豆杉樹皮內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae的發(fā)酵液中分離得到了紫杉醇,這一發(fā)現(xiàn)使紅豆杉屬植物中內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物的研究成為熱點(diǎn),并發(fā)現(xiàn)許多內(nèi)生真菌都能夠產(chǎn)生紫杉醇或具有紫杉醇類似結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物[47]。本研究對(duì)產(chǎn)自廣東的南方紅豆杉進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離和鑒定,探討南方紅豆杉內(nèi)生真菌的多樣性,并對(duì)分離到的內(nèi)生真菌的發(fā)酵粗提物進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性研究,旨在篩選出具有良好抗腫瘤活性的菌株,為進(jìn)一步研究其活性次生代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        南方紅豆杉樣品,包括葉、枝條、果實(shí)及樹皮,2008年10月采自廣東省大東山自然保護(hù)區(qū)。

        Taq酶及其他PCR相關(guān)試劑購于大連寶生物工程有限公司,其他分析純化學(xué)試劑均為市售。

        人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268、人肺癌細(xì)胞NCIH460、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7,均保存于廣東省微生物研究所。

        DMI 3000 B倒置顯微鏡(Leica);S-3000 N掃描電鏡(日立);EPS 3501電泳儀(Amersham Pharmacia Biotech); ImageQuant 350 凝膠成像儀;LAMBDA-E酶標(biāo)儀(Biotech);2123-2二氧化碳培養(yǎng)箱(Shellab);Mastercycler gradient 5331 PCR儀(Eppendof);RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);THZ-C-1搖床(廣州市正一科技有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 內(nèi)生真菌的分離 將采集的新鮮樣品用流水沖洗,然后用無菌水漂洗2次,放入75%的乙醇中浸泡7 min,取出后用無菌水漂洗3次,再放入0.1%的升汞溶液中浸泡5-7 min,取出后用無菌水漂洗4次。葉片用無菌剪刀剪去邊緣后剪成約0.5 cm×0.5 cm 的方塊;枝條用無菌手術(shù)刀削去四周,取中間部位剪成1 cm長的小段;樹皮用手術(shù)刀去掉外皮層后,剪成0.5 cm×0.5 cm小塊;果實(shí)剝?nèi)ネ馄?,取中間部位,剪成小塊。用最后一次漂洗用的無菌水涂板作為陰性對(duì)照。處理好的樣品放入事先準(zhǔn)備好的PDA平板(含20 μg/mL卡那霉素和20 μg/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)基中,26℃恒溫培養(yǎng),待長出菌絲后,挑取平板中單一菌落進(jìn)一步純化,純化后的菌株轉(zhuǎn)接到裝有PDA培養(yǎng)基的斜面上,4℃冰箱保存。

        1.2.2 內(nèi)生真菌的鑒定

        1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 肉眼觀察分離菌株在PDA平板上的培養(yǎng)特征;用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲、孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等形態(tài)特征;用掃描電鏡觀察部分菌株的孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征;參考《真菌鑒定手冊》[8],對(duì)分離菌株進(jìn)行初步鑒定。

        掃描電鏡樣品制備和觀察:將PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-10 d的培養(yǎng)物連同培養(yǎng)基一起切成0.5 cm× 0.5 cm的小塊,經(jīng)3%戊二醛固定5 h,PBS緩沖鹽洗滌;1%鋨酸固定2 h,PBS緩沖鹽洗滌;乙醇、丙酮脫水后,用乙酸異戊酯置換其中的溶劑(2次)。完全脫水后的樣品臨界點(diǎn)干燥3 h,噴金,掃描電鏡觀察。

        1.2.2.2 分子鑒定 總DNA的制備參考王磊等[9]的方法。PCR擴(kuò)增采用真菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA ITS)通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3',正向)和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',反向)[10]擴(kuò)增分離菌株的rDNA ITS區(qū)。PCR采用20 μL反應(yīng)體系,通過Ex Taq(TaKa-Ra)進(jìn)行,反應(yīng)條件為93℃預(yù)變性3 min;93℃變性45 s,55℃復(fù)性45 s,72℃延伸1.5 min,共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(QIAGEN)純化,純化后的樣品由廣州景瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序獲得的序列通過BLAST 程序在GenBank上進(jìn)行相似性序列檢索分析。

        1.2.3 細(xì)胞毒活性研究

        1.2.3.1 發(fā)酵液提取物的制備 從斜面挑取少許菌絲接種到PDA平板上活化3 d,挑取活化后的菌絲(連同培養(yǎng)基)轉(zhuǎn)接到裝有500 mL PD培養(yǎng)基的1 L的三角瓶中,26℃,120 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)物抽濾后,收集濾液,濾液用乙酸乙酯萃取3次,萃取液于40℃下減壓濃縮至干,得到發(fā)酵液粗提物備用。

        1.2.3.2 發(fā)酵粗提物的細(xì)胞毒活性測定 采用MTT法[11]測定發(fā)酵粗提物對(duì)腫瘤細(xì)胞SF-268、NCIH460和MCF-7的生長抑制率,各粗提物的作用濃度為100 μg/mL,以順鉑作為陽性對(duì)照,作用濃度為20 μg/mL,每處理重復(fù)3次。

        2 結(jié)果

        2.1 內(nèi)生真菌的分離及鑒定

        從南方紅豆杉的葉、枝條、樹皮及果實(shí)中共分離到內(nèi)生真菌55株,根據(jù)培養(yǎng)特征將這些菌株分成32類,測序后獲得22條不同的序列,將這些序列通過BLAST 程序在GenBank上進(jìn)行序列相似性檢索分析,結(jié)果見表1。

        從表1可以看出,分離菌株中能確定種的有膠孢刺盤孢(Colletotrichum gloeosporioides)、芒果球座菌(Guignardia mangiferae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、暗色節(jié)菱孢(Arthrinium phaeospermum)和細(xì)交鏈孢菌(Alternaria alternata);確定到屬的有炭角菌屬(Xylaria)、毛殼菌屬(Chaetomium)、擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)和長蠕孢屬(Helminthosporium);只能確定為植物內(nèi)生真菌而未能確定其種屬的有4株;而菌株A213、A220、A239和A241與最相似物種的相似率低,分別為92.1%、94.9%、93.1%和92.3%,有待作進(jìn)一步鑒定。A213、A220、A239、A241的形態(tài)特征見圖1及表2。

        表 1 分離及測序結(jié)果

        2.2 內(nèi)生真菌的抗腫瘤活性

        除了菌株A229和A232外,對(duì)其余20個(gè)菌株的發(fā)酵粗提物進(jìn)行了體外細(xì)胞毒活性測試,結(jié)果見表3。從表3中可以看出,有4株內(nèi)生真菌對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268的抑制率在50%以上,有2株對(duì)肺癌細(xì)胞NCI-H460的抑制率在50%以上,有6株對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制率在50%以上,其中菌株A223和A240對(duì)MCF-7的抑制率均在90%以上。

        圖1 菌株形態(tài)特征

        表 2 菌株A213、A220、A239、A241的形態(tài)特征

        表3 發(fā)酵粗提物細(xì)胞毒活性(作用濃度為100 μg/mL)

        3 討論

        內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)廣泛分布,這種分布既有一定的宿主或組織專一性,又受宿主生長環(huán)境的影響,具有豐富的多樣性。同一植物在不同的地理區(qū)域具有不同的內(nèi)生真菌類群分布[12]。紅豆杉的內(nèi)生真菌多樣性豐富,到目前為止已從紅豆杉屬植物中分離到不少不同種屬的內(nèi)生真菌(表4)。與已報(bào)道的南方紅豆杉內(nèi)生真菌比較,本研究首次從生長于廣東地區(qū)的南方紅豆杉中分離獲得了以往未見報(bào)道的內(nèi)生真菌,且菌株A213、A220、A239、A241與GenBank中最相似物種的相似率低,是否為新的種屬有待進(jìn)一步研究。可見,從不同地理區(qū)域的南方紅豆杉中可以獲得不同類群的內(nèi)生真菌資源。

        紅豆杉內(nèi)生真菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究逐漸被人們所重視,已成為研究抗腫瘤藥物和其他藥物的重要資源。如從太平洋紅豆杉植物內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae中分離得到的紫杉醇是一種活性很好的抗微管蛋白聚合的藥物,已經(jīng)被開發(fā)成為抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床。此外,人們還從紅豆杉屬植物中分離到能夠產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)的其他真菌。如王建鋒[27]等從紅豆杉皮層中分離到一株瘤座孢(Tubercularia sp.),發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液提取物在體外有較強(qiáng)的抗腫瘤活性;李桂玲[16]等從三尖杉、南方紅豆杉及香榧中分離到172株植物內(nèi)生真菌,利用MTT法對(duì)其進(jìn)行活性檢測表明,25株內(nèi)生真菌對(duì)KB人口腔上皮癌或HL-60人白血病細(xì)胞具有顯著的抑制作用。本研究對(duì)20株內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提物進(jìn)行細(xì)胞毒活性研究,結(jié)果有6株對(duì)至少1種受試腫瘤細(xì)胞株的抑制率在50%以上,占受試菌株總數(shù)的30%,其中菌株A223和A240對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制率在90%以上,值得對(duì)其活性次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入研究。

        表4 部分南方紅豆杉及其同屬植物中的內(nèi)生真菌

        4 結(jié)論

        本研究首次從南方紅豆杉中分離獲得了球座菌屬、座腔菌屬、炭角菌屬、節(jié)菱孢屬及長蠕孢屬的內(nèi)生真菌,豐富了南方紅豆杉內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量;活性研究發(fā)現(xiàn)部分內(nèi)生真菌的發(fā)酵粗提物具有良好的細(xì)胞毒活性。

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