張亞茹，沈才洪，鄭有麗，盧中明，敖宗華，叢峰松,*

(1.上海交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200240；2.四川瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000)

長(zhǎng)期以來(lái)，酒精在腫瘤發(fā)展過(guò)程中所扮演的角色一直是不清楚的[1]。通常，白酒本身被認(rèn)為是具有致癌性的。Mufti等[2]提出，在化學(xué)性的誘導(dǎo)食道癌過(guò)程中，白酒作為一個(gè)促進(jìn)劑出現(xiàn)，但是在這個(gè)過(guò)程開(kāi)始之前以及開(kāi)始期間，它又抑制了腫瘤的發(fā)生率。Hayashi等[3]認(rèn)為，慢性白酒促進(jìn)了1,1-二甲肼所誘導(dǎo)的結(jié)腸癌的生成，進(jìn)一步證實(shí)了Mufti等的觀點(diǎn)。然而，楊連君等[4]認(rèn)為，低劑量乙醇能夠明顯地誘導(dǎo)HCC-9204肝癌細(xì)胞凋亡。目前，白酒與腫瘤的關(guān)系還沒(méi)有定論。

在自然界，水由2個(gè)氫原子和1個(gè)氧原子組成，其中氫元素有氕、氘和氚3種同位素。在地表水中，氘和氕的比率大約是1：6600，即水中氘的體積分?jǐn)?shù)為0.015%[5]。通常把氘體積分?jǐn)?shù)低于0.015%的水稱為低氘水(DDW)。關(guān)于DDW的抑制腫瘤研究方面，Somlyai等[6]報(bào)道，DDW可以抑制小鼠成纖維L929細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和引起移植瘤小鼠腫瘤組織消退。俄羅斯研究人員最近發(fā)現(xiàn)，如果把普通水中氘的體積分?jǐn)?shù)減少65%，就會(huì)表現(xiàn)出一定的抗腫瘤特性，抑制瘤小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，DDW能抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠存活期[6-8]。本課題的研究也進(jìn)一步證實(shí)，氘體積分?jǐn)?shù)為0.0050% DDW在體內(nèi)外均可抑制腫瘤的生長(zhǎng)[9]。

中國(guó)白酒與水的關(guān)系密切。選擇合適的發(fā)酵用水或加槳降度以提高酒的品質(zhì)，降低白酒對(duì)人體的危害性，一直以來(lái)是人們關(guān)注的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)探討了低氘水、白酒以及低氘白酒對(duì)人肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料

BALB/c裸鼠60只，5～6周齡，雄性，(20±2)g，購(gòu)自必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滬)]。飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫25℃，濕度40%～70%之間，自由進(jìn)食與飲水。

白酒由瀘州老窖股份有限公司提供。

1.2 試劑與儀器

人肺腺癌細(xì)胞株H460 上海市中國(guó)醫(yī)學(xué)科院細(xì)胞研究所；人肺癌細(xì)胞株A549 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。DDW(體積分?jǐn)?shù)0.0050%) 上海池天超輕水生物工程有限公司；胎牛血清 杭州四季清公司；RPMI1640培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；MTT、TUNEL和Anexin-Ⅴ試劑盒 南京凱基生物公司。

Multiskan MK3型酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；倒置顯微鏡 日本尼康公司；HF151UV CO2培養(yǎng)箱 立申儀器有限公司；超凈工作臺(tái)(凈化效率100級(jí)) 瑞士梅特勒-托利多公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀型號(hào) 美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌細(xì)胞株A549和H460分別在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基、5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶中，90%的細(xì)胞匯合時(shí)，用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT法

A549細(xì)胞(104個(gè)/孔)接種于96孔培養(yǎng)板中。共分為4組，空白組：由正常1640培養(yǎng)基培；白酒組：在正常培養(yǎng)基中加入0～300mmol/L酒精，設(shè)置不同的酒精濃度梯度，以便測(cè)出最佳酒精作用濃度；DDW組：氘體積分?jǐn)?shù)為0.00050%；DDA組：DDW配制的培養(yǎng)基中含0～300mmol/L的酒精。不同組別培養(yǎng)A549細(xì)胞24、48、 72h，分別加入50μL MTT試劑溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸凈培養(yǎng)液后每孔加150μL DMSO，振蕩10min，選擇550nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的OD值。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.3.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

空白組、白酒組(含180mmol/L酒精)、DDW組以及DDA組(含180mmol/L酒精)培養(yǎng)A549 細(xì)胞48、72h。陰性對(duì)照組：正常條件下培養(yǎng)，標(biāo)記過(guò)程中不加TDT Enzyme。陽(yáng)性對(duì)照組：A549細(xì)胞用1000U DNaseⅠ反應(yīng)液處理。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，選擇蘇木素進(jìn)行復(fù)染。光學(xué)顯微鏡觀察，細(xì)胞體積縮小及變形；核濃染及喪失亞形態(tài)結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)核染色質(zhì)呈新月型，或者核碎裂成大小不等的核碎片，即典型凋亡的形態(tài)學(xué)改變。每張片子隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

培養(yǎng)A549細(xì)胞48、72h，收集空白組、白酒組、DDW組以及DDA組的細(xì)胞。用PBS洗兩次，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，約1～2min后終止消化。離心收集細(xì)胞，用PBS洗2次后棄上清，加500μL Binding Buffer懸浮，加5μL PI后混勻，再加入5μL FITC混勻，避光反應(yīng)10min，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.5 人肺腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型的建立和分組

將裸鼠隨機(jī)分為6組：空白組、白酒低劑量(CL)組(V(白酒)：V(超純水)=1：5.7)、白酒高劑量(CH)組(V(白酒)：V(超純水)=1：3)、DDW組、DDA低劑量(DDAL)組(V(白酒)：V(DDW)=1：5.7)、DDA高劑量(DDAH)組(V(白酒)：V(DDW)=1：3)，每組10只。DDW組、DDAL組和DDAH組，提前飲用滅菌DDW，其他3組正常飼養(yǎng)。2周后，收集人肺癌細(xì)胞H460株，調(diào)整密度為1×107個(gè)/mL，用1mL注射器取上述細(xì)胞懸液0.2mL(含細(xì)胞數(shù)目2×106個(gè))，注射于裸鼠右腋部皮下，即完成裸鼠腫瘤接種。

1.3.6 給藥情況及樣本的采集

造模當(dāng)日灌胃，每天灌胃1次，每次0.2mL。25d后，采血后斷頸處死荷瘤裸鼠，剝?nèi)∑は聦?shí)體瘤瘤塊，剔除筋膜，用電子天平分別稱質(zhì)量。計(jì)算各組瘤質(zhì)量和抑瘤率。－70℃保存小鼠肺、肝、腎、脾以及瘤體，后續(xù)以備進(jìn)行病理以及蛋白檢測(cè)之用。

1.3.7 腫瘤生長(zhǎng)情況及抑瘤效果的觀察

造模10d，每3d測(cè)量瘤體的最長(zhǎng)徑(a)和最短徑(b)，根據(jù)式(2)計(jì)算腫瘤體積(V)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。最后一次灌胃24h后剝離瘤體，按公式(3)計(jì)算抑瘤率。

1.3.8 HE染色

取血后，頸椎脫臼處死動(dòng)物，取瘤體、肝、肺組織于4%中性甲醛固定、取材、脫水、石蠟包埋、4μm厚切片、HE染色、封固，光鏡條件下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析，兩組間的差異比較，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度酒精對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

圖 1 不同酒精濃度與A549細(xì)胞增殖的關(guān)系Fig.1 Effect of alcohol on the proliferation of A549 cells

已知高劑量的白酒對(duì)細(xì)胞有損傷作用，本研究首先確定體外實(shí)驗(yàn)白酒的劑量。由圖1可知，在酒精濃度為180、200mmol/L處，細(xì)胞的增殖率幾乎相等，分別為88.429%、88.943%，而酒精濃度超過(guò)200mmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖隨著酒精濃度的增加被抑制，因此體外MTT的酒精濃度范圍確定為150～200mmol/L。

在上述初定范圍內(nèi)，分別選取150、180、200mmol/L 3個(gè)不同酒精濃度，進(jìn)一步確定最佳細(xì)胞增殖抑制濃度。

由圖2A可知，與空白組比較，DDW組、白酒組(含150mmol/L酒精)及DDA組(含150mmol/L酒精)細(xì)胞增殖受到抑制(P＜0.05)。其中，在72h時(shí)，DDA組(細(xì)胞增殖率為(71.88±2.47)%與白酒組(細(xì)胞增殖率為(91.81±3.70)%)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；DDA組與DDW組(細(xì)胞增殖率為(72.96±1.22)%)比較，無(wú)顯著性差異。

由圖2B可知，與空白組比較，DDW組、白酒組(含180mmol/L酒精)及DDA組(含180mmol/L酒精)細(xì)胞增殖受到抑制(P＜0.05)。其中，在72h時(shí)，DDA組(細(xì)胞增殖率為(70.58±2.73)%)與白酒組(細(xì)胞增殖率為(94.36±3.31)%)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DDA組與DDW組(細(xì)胞增殖率為(72.96±1.22)%)比較，無(wú)顯著性差異。

由圖2C可知，與空白組比較，DDW組、白酒組(含200mmol/L酒精)及DDA組(含200mmol/L酒精)細(xì)胞增殖受到抑制(P＜0.05)。其中，DDA組與白酒組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在48h時(shí)，DDA組(細(xì)胞增殖率為(77.50±2.00)%)與DDW組(細(xì)胞增殖率為(81.25±0.72)%)比較，無(wú)顯著性差異。

圖 2 3種不同酒精濃度對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of alcohol concentration on the proliferation of A549 cells

含酒精180mmol/L的白酒組、含酒精150mmol/L的白酒組與含酒精200mmol/L的白酒組比較，前者對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用介于后兩者之間，故本研究選定180mmol/L酒精濃度進(jìn)行后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)。

2.2 TUNEL 法檢測(cè)DDA對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL檢測(cè)顯示，DDW、DDA以及白酒作用A549 細(xì)胞48、72h后，引起細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡特征(圖3)。空白組細(xì)胞的凋亡率為(8.468±1.203)%，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(36.762±2.733)%。DDW組、白酒組以及DDA組與空白組比較，能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)，DDW組以及DDA組與白酒組比較，能顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。DDA組與白酒組比較，細(xì)胞凋亡更加顯著(P＜0.05)。隨著時(shí)間的推移，相同濃度白酒組之間，凋亡率增加(圖4)。

圖 3 TUNEL法檢測(cè)DDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(×400)Fig.3 DDA-induced apoptosis of A549 cells evaluated by TUNEL method (×400)

圖 4 圖片顯示TUNEL數(shù)據(jù)Fig.4 Plot of the TUNEL data

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DDA引起的A549細(xì)胞凋亡

用DDW、DDA和白酒組分別培養(yǎng)A549細(xì)胞，48h后收集處理，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，如圖5所示。

圖 5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Fig.5 DDA-induced apoptosis of tumor cells evaluated by FCM assay

表 1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DDA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(±s)Table 1 DAA-induced apoptosis of tumor cells evaluated by FCM assay (±s) %

表 1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DDA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(±s)Table 1 DAA-induced apoptosis of tumor cells evaluated by FCM assay (±s) %

組別48h72h空白組2.23±0.211.45±0.20 DDW組2.64±0.172.58±0.15白酒組4.59±0.236.99±0.39 DDA組4.04±0.145.80±0.54

由表1可知，作用48h時(shí)，空白組細(xì)胞凋亡率為(2.23±0.21)%，DDW組細(xì)胞凋亡率為(2.64±0.17)%，白酒組凋亡率為(4.59±0.23)%，DDA組凋亡率為(4.04±0.14)%。作用72h后則各組凋亡率與48h的各組凋亡率無(wú)明顯變化。

2.4 DDA對(duì)肺癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制

治療前各組裸鼠生理狀態(tài)無(wú)明顯差異。由圖6可知，灌胃9d后，各組腫瘤體積均有所增長(zhǎng)，除CH組與空白組外，其他各組腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯緩慢。其中DDAL組瘤體生長(zhǎng)最為緩慢，其次是DDW組，接著是DDAH組和CL組。由表2可知，DDAL組抑瘤率為31.014%，DDW組抑瘤率為27.639%，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CH組對(duì)移植瘤生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。

圖 6 肺癌移植瘤生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curve of xenograft with lung cancer cells

表 2 裸鼠移植瘤體積以及抑瘤率(±s) Table 2 Volumes and inhibitory rates of H460 cells in nude mice (±s)

表 2 裸鼠移植瘤體積以及抑瘤率(±s) Table 2 Volumes and inhibitory rates of H460 cells in nude mice (±s)

注：*.與空白組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

組別數(shù)量瘤體體積/cm3抑瘤率/%空白組102.56±0.56 DDW組101.85±0.1327.639*DDAL組101.77±0.2331.014*DDAH組92.14±0.6616.531 CL組102.05±0.1319.584 CH組102.75±1.26－7.64

2.5 HE染色觀察移植瘤、肺、肝組織病理變化

圖 7 HE染色法檢測(cè)腫瘤組織的病理變化(×100)Fig.7 Pathological change of tumor tissues with HE staining (×100)

由圖7可知，空白組中腫瘤細(xì)胞排列密集，組織生長(zhǎng)活躍(圖7D)。相比較之下，DDW組與DDAL組，腫瘤細(xì)胞周圍有壞死的組織，腫瘤細(xì)胞的數(shù)量明顯低于空白組(圖7A、B)。而CL組和DDAH組與空白組比較，腫瘤細(xì)胞排列更為松散，有壞死的腫瘤細(xì)胞(圖7C、E)。CH組中腫瘤細(xì)胞排列緊密，切片顯示腫瘤組織中有血管，癌細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛(圖7F)。

圖 8 HE染色法檢測(cè)肺組織的病理變化(×100)Fig.8 Pathological change of lung tissues with HE staining (×100)

由圖8裸鼠肺部組織HE染色可知，空白組中小鼠肺部正常無(wú)腫瘤病灶產(chǎn)生，肺部有完成的肺泡，肺泡管及肺泡囊、肺泡和肺泡之間的間隔正常(圖8D)。其余各組的肺泡結(jié)構(gòu)與空白組比較，無(wú)病理變化(圖8A～F)。

圖9裸鼠肝臟組織HE染色顯示，空白組中小鼠的肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞形態(tài)，大小結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間界限清晰(圖9D)。其余各組的肝部結(jié)構(gòu)與空白組比較，無(wú)病理變化(圖9A～F)。

圖 9 HE染色法檢測(cè)肝組織的病理變化(×100)Fig.9 Pathological change of liver tissues with HE staining (×100)

3 討 論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，低劑量低氘白酒在體內(nèi)外均能顯著抑制人肺腺癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。MTT結(jié)果顯示，與同濃度的白酒組比較，低氘白酒能顯著抑制肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)。TUNEL法檢測(cè)表明低氘白酒、低氘水以及白酒均能引起A549細(xì)胞凋亡。其中，低氘白酒比白酒組誘導(dǎo)凋亡更顯著。同時(shí)，隨著時(shí)間的推移，凋亡率增加。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)低氘白酒、低氘水以及白酒均能引起A549細(xì)胞凋亡，與正常組比較，低氘白酒誘導(dǎo)了更多的凋亡。目前認(rèn)為，酒精抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的可能性機(jī)制為：1)導(dǎo)致細(xì)胞染色體受到損傷，DNA發(fā)生斷裂，DNA修復(fù)酶的功能受到抑制[10]；2)致使細(xì)胞內(nèi)電子傳遞鏈?zhǔn)盏綋p傷，ATP合成的功能受到損害，激發(fā)脂質(zhì)的過(guò)氧化，促使細(xì)胞內(nèi)生物膜的流動(dòng)性發(fā)生改變[11]；3)酒精代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，潛在的造成細(xì)胞的損傷，影響細(xì)胞的增殖。已有的研究表明[9]，低氘水主要是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生作用的。在體外，低氘水和酒精共同促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞凋亡。

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)高劑量白酒促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，而低劑量白酒抑制腫瘤生長(zhǎng)。已有的研究指出[12]長(zhǎng)期攝入酒精能增大腫瘤并增加血管生成因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的水平。研究還發(fā)現(xiàn)，低劑量的低氘白酒能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，且與空白組比較，具有顯著性差異，并且較其他實(shí)驗(yàn)組抑瘤效果好。病理觀察顯示，低氘白酒組瘤組織細(xì)胞排列松散，并發(fā)現(xiàn)有壞死腫瘤細(xì)胞。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低氘水與白酒聯(lián)合使用具有協(xié)同作用進(jìn)一步抑制了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

肝、肺病理切片顯示，低氘水組和低氘白酒組小鼠的肝、肺組織正常，無(wú)明顯病理變化，與Kovacs等[13]的結(jié)論一致。未來(lái)抗腫瘤藥物的研究方向?qū)⑹歉咝У投荆虼说碗哂羞M(jìn)一步深入研究的價(jià)值。

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