劉恩岐，李 華*，巫永華，張建萍，陳振家

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.徐州工程學(xué)院，江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇 徐州 221008；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801)

黑豆與黃大豆的主要營養(yǎng)成分十分相似，且黑豆蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸組成總體優(yōu)于黃豆，有研究報道[1-2]黑豆蘇氨酸含量比黃豆高15.3%，蛋氨酸高29.0%，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白資源。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，通過對蛋白質(zhì)適當(dāng)酶解可以得到具有各種功能的生物活性肽[3]，通過酶法水解黑豆蛋白制備生物活性肽，價廉易得，安全性高，具有良好的開發(fā)前景[4]。疲勞是體力活動時出現(xiàn)原有工作能力暫時下降的一種正常生理現(xiàn)象，又可能是機(jī)體發(fā)展到傷病狀態(tài)的一種先兆[5]。自由基理論認(rèn)為，抗氧化與緩解體力疲勞具有一定的關(guān)系，人體運(yùn)動時血紅蛋白的氧化速度增加，產(chǎn)生的自由基大量消耗機(jī)體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)，打破了正常生理條件下自由基生成和清除之間的動態(tài)平衡，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、功能降低而使機(jī)體產(chǎn)生疲勞[6-8]。陳園園[9]、王勇剛[10]等研究顯示，大豆肽的抗氧化能力與抗疲勞效果具有顯著的正相關(guān)性。本實驗采用Alcalase堿性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶和Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶對黑豆蛋白進(jìn)行組合水解，通過超濾和大孔樹脂吸附分離獲得抗氧化活性較強(qiáng)的黑豆肽，按照我國衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行緩解體力疲勞動物研究，并對抗氧化與緩解體力疲勞黑豆肽組分進(jìn)行相對分子質(zhì)量分布和氨基酸組成分析，為功能性黑豆肽的開發(fā)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

晚熟小粒黑豆由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆育種研究室提供；健康雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，均為SPF級，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

Alcalase、Neutrase、Flavourzyme蛋白酶 丹麥諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；DA201-C大孔吸附樹脂 江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司；乳酸試劑盒、尿素氮試劑盒、肝糖元試劑盒 南京建成生物工程研究所；還原型谷胱甘肽 美國Amresco公司；甲醇、乙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品 Fluka進(jìn)口分裝。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Synergy H1全功能酶標(biāo)儀 美國Bio Tek公司；Alpha1-2 LO plus真空冷凍干燥機(jī) 德國Christe公司；Labscale TFF小型切向流超濾系統(tǒng) 美國Millipore公司；5417R臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；HYG-Ⅱ恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)、Sephadex G-25凝膠過濾色譜柱 美國安瑪西亞公司；玻璃游泳箱(50cm×50cm×40cm)。

1.2 黑豆肽的制備與抗氧化活性測定

1.2.1 酶法水解制備黑豆肽粗粉

采用堿提酸沉法提取黑豆蛋白，將質(zhì)量濃度為5g/100mL的黑豆蛋白水溶液于90℃加熱10min使蛋白質(zhì)變性，冷卻至60℃用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)至pH8.5，加入Alcalase酶水解30min，pH值降到7.0左右，加入Neutrase酶50℃水解60min，pH值降到6.0左右，再加入Flavourzyme酶水解30min，在pH值漸變條件下，對黑豆蛋白進(jìn)行分步組合水解，以提高酶解液的水解度和多肽含量[11-12]。加熱滅酶冷卻后，于4000r/min離心10min取上清液，經(jīng)冷凍干燥得到黑豆肽粗粉。

1.2.2 黑豆肽粗粉的超濾與大孔樹脂吸附分離

分別用截留相對分子質(zhì)量為3000、5000和10000的超濾膜對黑豆肽進(jìn)行分離[13]，凍干后測定其DPPH自由基清除率。采用DA201-C樹脂對抗氧化活性較強(qiáng)的黑豆肽超濾組分進(jìn)行充分吸附[14]，依次用體積分?jǐn)?shù)為25%、50%、75%和100%乙醇洗脫3h，得到按疏水性大小分離的黑豆肽組分[15]，凍干后測定其DPPH自由基清除率。以抗氧化活性相對最強(qiáng)的大孔樹脂吸附分離黑豆肽組分進(jìn)行緩解體力疲勞的動物實驗。

1.2.3 DPPH自由基清除率的測定[16]

在96孔酶標(biāo)板中，加入質(zhì)量濃度為1mg/mL的黑豆肽樣品和0.2mg/mL的DPPH甲醇溶液各100μL，應(yīng)用Bio Tek酶標(biāo)儀振蕩30s，常溫條件下避光放置20min，于517nm波長處測定其吸光度(A1)；同時測定加黑豆肽樣品但不加DPPH(以同體積甲醇代替DPPH)的空白吸光度(A0)，加DPPH但不加樣品(以同體積甲醇代替樣品)的吸光度(A2)，按公式(1)計算DPPH自由基清除率。

1.3 黑豆肽緩解體力疲勞功能動物實驗

1.3.1 實驗動物分組與給藥

由徐州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心進(jìn)行動物實驗。將小鼠隨機(jī)分為空白對照組、谷胱甘肽陽性對照組(GSH陽性對照組)和黑豆肽低、中、高劑量組5組，每組25只小鼠[17]。樣品組低、中、高劑量組分別灌胃250、500、1000mg/(kg·d)黑豆肽，空白對照組灌胃1000mg/(kg·d)生理鹽水，谷胱甘肽陽性對照組灌胃50mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃30d[18]。

1.3.2 負(fù)重游泳

小鼠末次灌胃30min后，將其尾根部負(fù)荷5%體質(zhì)量的鉛絲，置于玻璃游泳箱中游泳，水深40cm，水溫(25.0±1.0)℃，記錄小鼠從游泳開始至頭部沒入水面以下7s不再上浮的時間。

1.3.3 血乳酸含量測定

小鼠末次灌胃30min后，置于水溫(30.0±1.0)℃游泳箱中不負(fù)重游泳10min后取出，立即拔眼球采血100μL，用乳酸試劑盒測定血乳酸含量。

1.3.4 血清尿素氮含量測定

小鼠末次灌胃30min后，置于水溫(30.0±1.0)℃游泳箱中不負(fù)重游泳90min，休息60min后拔眼球采全血0.5mL，置于4℃冰箱約3h，血凝固后2000r/min離心15min取血清，采用尿素氮試劑盒測定血清尿素氮含量。

1.3.5 肝糖原含量測定

小鼠末次灌胃30min后，置于水溫(30.0±1.0)℃游泳箱中不負(fù)重游泳90min，休息60min后，立即處死，取肝臟，采用肝糖原測試盒測定小鼠肝糖原含量。

1.4 黑豆肽的相對分子質(zhì)量分布與氨基酸組成測定

1.4.1 相對分子質(zhì)量測定

采用Sephadex G-25凝膠色譜柱對黑豆肽進(jìn)行相對分子質(zhì)量分布測定。黑豆肽樣品質(zhì)量濃度為500mg/mL，12000r/min離心5min，取上清液進(jìn)樣，上樣量為0.5mL。以Tris-HCl緩沖液(pH7.0，20mmol/L)為洗脫液，洗脫流速1.5mL/min，通過紫外檢測儀在280nm波長處檢測，自動收集各洗脫峰，冷凍干燥各洗脫組分并測定其DPPH自由基清除率。

相對分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為：牛血清蛋白(Mr6640)、抗菌肽(Mr1422)、氧化型谷胱甘肽(Mr612)、還原型谷胱甘肽(Mr307)、L-半胱氨酸(Mr121)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品洗脫體積V(mL)與其相對分子質(zhì)量對數(shù)值(lgMr)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如式(2)所示。

1.4.2 氨基酸組成測定

采用氨基酸自動分析儀測定黑豆肽中除色氨酸外的氨基酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆肽的抗氧化活性

2.1.1 黑豆肽超濾分離組分的抗氧化活性比較

表 1 黑豆肽超濾分離組分的DPPH自由基清除率比較(±s)Table 1 DPPH free radical scavenging activity of fractions from ultrafiltration (±s)

表 1 黑豆肽超濾分離組分的DPPH自由基清除率比較(±s)Table 1 DPPH free radical scavenging activity of fractions from ultrafiltration (±s)

相對分子質(zhì)量(Mr)＞100005000～10000 3000～5000＜3000 DPPH自由基清除率/%25.06±0.5231.07±0.6737.41±0.7851.06±0.92

由表1可知，相對分子質(zhì)量＜3000的黑豆肽超濾組分具有相對最強(qiáng)的DPPH自由基清除率，因而基于該組分對黑豆肽進(jìn)行大孔樹脂吸附分離。

2.1.2 黑豆肽大孔樹脂吸附分離組分的抗氧化活性比較

表 2 黑豆肽大孔樹脂吸附分離組分的DPPH自由基清除率比較(±s)Table 2 DPPH free radical scavenging activity of fractions from DA201-C MAR purification (±s)

表 2 黑豆肽大孔樹脂吸附分離組分的DPPH自由基清除率比較(±s)Table 2 DPPH free radical scavenging activity of fractions from DA201-C MAR purification (±s)

洗脫乙醇體積分?jǐn)?shù)/%255075100 DPPH自由基清除率/%33.06±0.5250.07±0.6771.41±0.9161.06±0.72

由表2可知，DA201-C大孔樹脂吸附的75%乙醇洗脫分離的黑豆肽組分具有相對最強(qiáng)的DPPH自由基清除率，因此確定以該組分進(jìn)行緩解體力疲勞功能的動物實驗。

2.2 黑豆肽緩解體力疲勞功能動物

2.2.1 黑豆肽對小鼠負(fù)重游泳時間的影響

表 3 黑豆肽對小鼠負(fù)重游泳時間的影響(±s，n=8)Table 3 Effect of BSPs on loaded-swimming time in mice (±s，n=8)

表 3 黑豆肽對小鼠負(fù)重游泳時間的影響(±s，n=8)Table 3 Effect of BSPs on loaded-swimming time in mice (±s，n=8)

注：*.與空白對照組相比，差異顯著(P ＜0.05)；**.與空白對照組相比，差異極顯著(P ＜0.01)。表4 同。

組別空白對照組 GSH陽性對照組 低劑量組中劑量組高劑量組負(fù)重游泳時間/min 104.83±11.07 160.16±28.73** 148.50±20.12* 167.50±25.95** 194.83±25.98**

運(yùn)動耐力的提高是抗疲勞能力加強(qiáng)最直接的表現(xiàn)，負(fù)重游泳時間的長短可以反映動物運(yùn)動疲勞的程度[20]。由表3可知，黑豆肽組小鼠負(fù)重游泳時間與空白對照組相比均明顯延長，低劑量組具有顯著差異(P＜0.05)，中、高劑量組具有極顯著差異(P＜0.01)，由此可判定低、中、高劑量組實驗結(jié)果均為陽性，能顯著提高小鼠的運(yùn)動耐力。谷胱甘肽(GSH)是動植物體內(nèi)廣泛存在的抗氧化物質(zhì)[21]，中劑量組與GSH陽性對照組小鼠負(fù)重游泳時間十分接近，表明灌胃500mg/(kg·d)黑豆肽與灌胃50mg/(kg·d)谷胱甘肽的負(fù)重游泳效果基本相當(dāng)。

2.2.2 黑豆肽對小鼠血乳酸、血清尿素氮與肝糖原含量的影響

表 4 黑豆肽對小鼠血乳酸、血清尿素氮與肝糖原含量的影響(±s，n=8)Table 4 Effect of BSPs on mice of the contents of BLA, SUN and HG (±s，n=8)

表 4 黑豆肽對小鼠血乳酸、血清尿素氮與肝糖原含量的影響(±s，n=8)Table 4 Effect of BSPs on mice of the contents of BLA, SUN and HG (±s，n=8)

組別血乳酸含量/(mmol/L) 血清尿素氮含量/(mol/L) 肝糖原含量/(mg/g)空白對照組37.96±3.787.87±0.8512.41±0.13 GSH陽性對照組35.49±1.087.65±0.6914.47±0.28**低劑量組34.79±1.117.70±0.9914.62±0.36**中劑量組23.20±0.30**7.23±0.6617.87±1.02**高劑量組18.44±1.91**6.78±0.8921.96±0.42**

由表4可知，黑豆肽中、高劑量組的血乳酸(BLA)含量與空白對照組有極顯著差異(P＜0.01)，但低劑量組差異不顯著，由此可判定中、高劑量組結(jié)果均為陽性，能顯著減少運(yùn)動時乳酸的積累，從而緩解體力疲勞程度。黑豆肽低、中、高劑量組的血清尿素氮(SUN)含量與空白對照組均差異不顯著，據(jù)此推測黑豆肽不能通過降低SUN含量來延緩疲勞的產(chǎn)生。黑豆肽低、中、高劑量組的肝糖原(HG)含量與空白對照組都具有極顯著差異(P＜0.01)，由此可判定低、中、高劑量組結(jié)果均為陽性，能顯著增加肝糖原的儲備，從而延緩體力疲勞的發(fā)生。GSH陽性對照組的血乳酸和血清尿素氮2項生化指標(biāo)均與空白對照組差異不顯著，而HG含量指標(biāo)則均與空白對照組差異極顯著(P＜0.01)，表明其BLA、SUN和HG水平與低劑量黑豆肽組基本相當(dāng)。

2.3 抗氧化與緩解體力疲勞黑豆肽的相對分子質(zhì)量分布與氨基酸組成

2.3.1 抗氧化與緩解體力疲勞黑豆肽的相對分子質(zhì)量分布

圖 1 緩解體力疲勞黑豆肽的Sephadex G-25分離圖譜Fig.1 Sephadex G-25 chromatogram of anti-fatigue BSPs

由圖1可知，采用Sephadex G-25凝膠過濾色譜對抗氧化與緩解體力黑豆肽(BSP)進(jìn)一步分離共得到4個洗脫峰組分，各洗脫峰組分比例、相對分子質(zhì)量分布與DPPH自由基清除率見表5。P1和P4峰的DPPH自由基清除能力很弱，P1組分可能是一些水解度較低的大分子肽，P4組分可能是一些水解過度的游離氨基酸；P2、P3峰組分的DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，其中P3峰為主要組分，占64.4%，且DPPH自由基清除率最高，表明具有抗氧化、緩解體力疲勞功能的黑豆肽主要是一些相對分子質(zhì)量約在450～920之間的小肽。

表 5 緩解體力疲勞黑豆肽的Sephadex G-25分離圖譜分析Table 5 Results of chromatographic separation of anti-fatigue BSP on Sephadex G-25

2.3.2 抗氧化與緩解體力疲勞黑豆肽的氨基酸組成

據(jù)相關(guān)研究報道[22-23]，抗氧化肽多數(shù)是一些由3～7個氨基酸所組成的小肽，多肽鏈中的疏水性氨基酸和Tyr、Cys及His等可以提高肽的抗氧化能力，且抗氧化較強(qiáng)的小分子肽可以延緩自由基引發(fā)的疲勞。由表6可知，大孔樹脂吸附的75%乙醇洗脫黑豆肽組分的疏水性氨基酸含量較相對分子質(zhì)量＜3000的超濾組分明顯增加，特別是Phe、Val、Pro和Met等增加幅度較大，且中性極性氨基酸Thr、Cys和堿性氨基酸His等含量也有所增加，因而具有較強(qiáng)的抗氧化活性和緩解體力疲勞功能，這一結(jié)果與劉晶等[24]的研究報道一致。Sephadex G-25分離P3組分的疏水性氨基酸含量與大孔樹脂吸附的75%乙醇洗脫黑豆肽組分基本接近，Tyr、Cys略有增加，尤其是His增加幅度較大，且相對分子質(zhì)量較小，因而表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性，其緩解體力疲勞作用是否更強(qiáng)，有待于進(jìn)一步研究。

表 6 黑豆肽的氨基酸組成Table 6 Amino acid composition of black soybean peptides g/100g

3 結(jié) 論

通過超濾和DA201-C大孔樹脂對黑豆蛋白酶法水解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，相對分子質(zhì)量＜3000，以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗脫的黑豆肽具有相對最強(qiáng)的體外抗氧化活性。將該黑豆肽進(jìn)行緩解體力疲勞動物實驗，中、高劑量組小鼠負(fù)重游泳時間、運(yùn)動后血乳酸和肝糖原含量與空白對照組均具有極顯著差異(P＜0.01)，由此判定抗氧化黑豆肽具有緩解體力疲勞功能的作用。中劑量組(500mg/(kg·d))小鼠負(fù)重游泳時間、提高運(yùn)動耐力的效果與GSH陽性對照組(50mg/(kg·d))水平相當(dāng)，低劑量組(250mg/(kg·d))小鼠血乳酸、肝糖原含量，減少運(yùn)動時小鼠血乳酸積累、增加肝糖原儲備的作用與GSH陽性對照組水平相當(dāng)，說明實驗獲得的黑豆肽達(dá)到緩解體力疲勞同等效果的灌胃劑量約需GSH的5～10倍。

相對分子質(zhì)量分布和氨基酸組成分析表明，抗氧化黑豆肽主要是一些相對分子質(zhì)量約在450～920之間的小肽，具有Phe、Val、Pro、Met等疏水性氨基酸和抗氧化較強(qiáng)的Thr、Cys、His等含量較高的氨基酸組成特點，可以延緩由自由基引發(fā)的疲勞。

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