王明躍，張文學(xué)*，王海英，劉超蘭

(1.阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 阜陽 236031；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065)

五糧液、瀘州老窖等濃香型白酒以“窖香濃郁，綿甜醇厚、香味協(xié)調(diào)，回味悠長”的產(chǎn)品風(fēng)格特征為廣大消費者所喜愛，其窖香物質(zhì)的來源主要是窖泥微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸和酯類等代謝產(chǎn)物。泥窖池是濃香型白酒特有的發(fā)酵容器，也是優(yōu)良釀酒微生物棲息繁衍地，經(jīng)過高酸度、高酒精和長期密閉發(fā)酵等釀酒環(huán)境的篩選和馴化，窖泥中逐漸富集了大量具有產(chǎn)香功能的厭氧細菌[1]。生產(chǎn)實踐表明，窖池窖齡與釀酒質(zhì)量關(guān)系極為密切，隨著窖池使用年份的延長，窖泥逐漸趨于老熟，產(chǎn)生的香味物質(zhì)越多，且有一種香沁脾胃的窖泥香味。長期以來，人們不斷借助傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法對窖泥微生物區(qū)系的形成和演變規(guī)律進行研究，試圖揭開“老窖出好酒”的謎團，由于窖泥大部分細菌是不可培養(yǎng)的，其研究結(jié)果具有很大的局限性，且收效甚微。

近幾年，隨著基于PCR擴增技術(shù)的各種微生物免培養(yǎng)方法應(yīng)用于釀造微生物區(qū)系研究，使依賴于經(jīng)典微生物研究方法而難于分析的大量微生物菌群的相關(guān)信息不斷增加，王海英等[2]運用PCR-DGGE分析了白酒窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)，張文學(xué)等[3]利用16S rDNA克隆文庫技術(shù)研究白酒發(fā)酵糟醅中微生物區(qū)系的構(gòu)成及演變規(guī)律。因DGGE條帶分布只能反映出微生物種群中的優(yōu)勢種，測定序列長度較短，提供微生物種群多樣性信息非常有限[4]，尚不能系統(tǒng)地揭示窖泥的老熟機理，而16S rDNA克隆文庫技術(shù)獲得的種群分類信息相對客觀真實[5]，因而被廣泛用于揭示環(huán)境中微生物的多樣性[6]，目前，利用克隆文庫技術(shù)對窖泥微生物系統(tǒng)發(fā)育研究還鮮有文獻報道。鑒于此，本實驗通過構(gòu)建低齡窖(20a)、中齡窖(50a)和高齡窖(150a)窖泥細菌的16S rDNA克隆文庫，分析了濃香型白酒窖泥細菌隨隨窖齡的變化規(guī)律，以期全面、系統(tǒng)地認識白酒窖池細菌群落組成及與窖泥質(zhì)量性狀的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

窖泥樣品分別取自四川西部某國家名酒企業(yè)釀酒車間低齡窖(20a)、中齡窖(50a)和高齡窖(150a)窖池。取樣方法是從每個窖池窖底4個角落和接近中心的一點各取50g窖泥，混合均勻，分裝后密封冷凍保存。

1.2 方法

1.2.1 窖泥樣品預(yù)處理及總DNA提取

為了充分提取窖泥樣品中的總DNA，參照本實驗室窖泥樣品預(yù)處理方法[7]，向0.5g窖泥中加入600μL裂解液，反復(fù)凍融，收集上清液，經(jīng)基因組抽提試劑盒AC柱純化，用于PCR擴增。

1.2.2 窖泥樣品16S rDNA擴增

用細菌16S rDNA通用引物Eubac27f和Eubac1492r對所提取的窖泥樣品DNA進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考文獻[7]，擴增目的片段大小約為1500bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 窖泥樣品克隆文庫的構(gòu)建

將上述PCR產(chǎn)物與pUCm-T載體進行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，涂布在含氨芐青霉素和X-gal、IPTG的LB平板，37℃培養(yǎng)12～16h，用無菌槍頭挑取白斑菌落，轉(zhuǎn)移至LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)過夜，取800μL培養(yǎng)好的菌液至EP管，離心洗滌后進行菌體PCR，其余菌液留作測序。

1.2.4 16S rDNA擴增片段的ARDRA分型和測序

將鑒定為陽性克隆子的PCR產(chǎn)物進行限制性酶切分析(ARDRA)，用MspⅠ和HinfⅠ兩種限制性內(nèi)切酶消化，綜合雙酶切圖譜，將所有陽性克隆子分為若干分類操作單位(OTU)，其中，克隆子數(shù)量比例＞10%的OTUs為優(yōu)勢菌群，5%～10%之間的OTUs為次要優(yōu)勢菌群。將每個OTU類型挑取1～3個進行雙向測序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。所得合格序列均已提交日本國際基因數(shù)據(jù)庫DDBJ，序列登錄號：AB699152，AB699883～AB699898，AB700373～AB700425。

1.2.5 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將所得序列通過Geengenes在線分析檢查，去除嵌合體(chimera)，然后在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對，結(jié)合Ribosomal Database Project11分類結(jié)果，挑選最相似的親緣序列。利用Clustal X 1.83和Mega4.0軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining)對選取的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用覆蓋率[8]評價不同窖齡窖泥的庫容情況：覆蓋率/%=(1－n1/N)×100，式中：N代表窖泥文庫中克隆子總數(shù)，n1為文庫中只出現(xiàn)1次克隆子的數(shù)量。用EcoSim700軟件繪制Rarefaction曲線，評價窖泥細菌文庫是否較好地反映窖泥微細菌多樣性。通過Biodap軟件計算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)和索倫森相似性系數(shù)(Sorensen similarity index)，評價不同窖齡窖泥的細菌多樣性和相似程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥樣品16S rDNA克隆文庫分析

從3個不同窖齡的窖泥中共挑選398個陽性克隆子，經(jīng)ARDRA分析，共有66個OTUs。20、50、150a窖泥文庫的覆蓋率分別為97.1%、94.6%和97.8%，Rarefaction曲線趨于平緩，均達到平臺期(圖1)，說明所分析的克隆數(shù)已反映了窖泥中絕大部分的細菌多樣性。

圖 1 窖泥細菌16S rDNA克隆文庫稀有度曲線Fig.1 Rarefaction curves generated for 16S rDNA in clone libraries from pit mud

所得序列經(jīng)過Chimera檢查去除嵌合體后，然后在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對，相似性為89%～100%，相似性≥97%的序列只選取一個代表序列[9]，最終得到37個不同基因型的OTUs，其中25個OTUs序列的相似性≤97%，說明大多數(shù)克隆(67.5%)屬于“種”分類上的新發(fā)現(xiàn)的細菌。

表 1 不同窖齡窖泥細菌16S rDNA克隆文庫的多樣性和相似性Table 1 Diversity and similarity index of baeterial 16S rDNA clone libraries from the pit muds with different cellar ages

通過20、50、150a窖泥克隆文庫的分析結(jié)果(表1)可知，隨著窖齡的增加，窖泥細菌多樣性指數(shù)逐漸增加，這說明窖泥中的細菌通過長期馴化，已經(jīng)適應(yīng)酸、酒精等釀酒特定環(huán)境，加之生產(chǎn)過程中周期性地續(xù)渣配料及釀酒過程中逐漸積累的有機酸、醇類等物質(zhì)，久而久之，窖泥中優(yōu)良菌種就逐漸豐富起來。窖泥細菌多樣性指數(shù)從20～50a之間變化幅度較大，50～150a之間增加很小，兩者菌群相似程度也達到70.8%，說明窖泥中的菌群經(jīng)過50a的連續(xù)發(fā)酵，已趨于穩(wěn)定平衡狀態(tài)。

2.2 窖泥細菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育及代謝特性分析

由圖2 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，3 7 個基因型分屬于6個細菌門：厚壁菌門(Firmicute)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和未分類細菌(Unclassified Bacteria)。

厚壁菌門(Firmicute)包括25個OTUs，占克隆子數(shù)的65.1%，是窖泥中的絕對優(yōu)勢菌，同源性比對相似性為90%～99%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚成7個簇。

Cluster Ⅰ和Cluster Ⅶ屬于未分類的梭菌目(Clostridiales)和未分類的梭菌綱(Clostridia)，它們主要來自中齡(50a)、高齡(150a)窖泥，缺乏種屬分類信息，預(yù)示著中、高齡窖泥中蘊藏著豐富的未知微生物資源。其中AB700386為中、高齡窖泥優(yōu)勢菌，與來自滲濾液沉積物的克隆Uncultured bacterium clone De3230相似性為96%，可能是與甲烷菌共生，并能產(chǎn)生氫氣的細菌類群[10]，其數(shù)量和代謝能力是窖泥老熟的重要標志之一。

ClusterⅡ只有AB699887一個克隆，相似于Uncultured Caloramator sp.6b(95%)，在RDP數(shù)據(jù)庫中的分類卻屬于Fervidicella，可能是Fervidicella中未發(fā)現(xiàn)的新種。

Cluster Ⅲ類群克隆分屬于4 個屬，AB700409屬于Anaerovorax，AB699895屬于Proteiniborus。AB699897為20a窖齡窖泥次優(yōu)勢菌，相似于Uncultured Eubacteriaceae 08-2-D03(99%)，屬于Eubacterium，AB700382是50a窖齡窖泥次優(yōu)勢菌，相似于Uncultured Sedimentibacter sp. XZXXH123(94%)，這兩個種屬的細菌能夠產(chǎn)生乙酸和丙酸[11-12]。

ClusterⅣ是Ruminococcaceae類群，AB69988在3個不同窖齡窖泥中均有克隆檢出，相似于鐵還原細菌Ironreducing bacterium(95%)，能將窖泥中的鐵化合物從氧化態(tài)轉(zhuǎn)化成還原態(tài)，使窖泥顏色則有由紅棕黃褐等轉(zhuǎn)向灰白青，表現(xiàn)為老熟特征。AB699883相似于Uncultured Clostridium sp.B03(93%)，AB700411相似于Uncultured Clostridium sp.J4(96%)，Clostridium能夠利用乙醇和乙酸而成己酸，進而生成濃香型白酒主要香味成分己酸乙酯[13]，是濃香型白酒生產(chǎn)中重要的功能菌，如瀘型梭菌(Clostridium Lushun)等菌株已廣泛應(yīng)用于人工窖泥的生產(chǎn)[14]。

圖 2 窖泥厚壁菌門細菌16S rDNA克隆系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the16S rDNA sequences of Firmicute clones obtained from pit mud

ClusterⅤ是Syntrophomonadaceae類群，AB699889和AB699894均相似于互營共養(yǎng)單胞Syntrophomonas curvata GB8-1(96%，98%)，常常和產(chǎn)甲烷菌共生，能夠降解長鏈脂肪酸產(chǎn)生氫氣、乙酸、丙酸[15]。Syntrophomonas在3個不同窖齡窖泥中均有分布，在低齡(20a)窖泥中包括AB699889和AB699894兩個種屬，其中AB699889是20a窖泥第一優(yōu)勢OTUs，所占比例為20.7%，在中齡(50a)、高齡(150a)窖泥比例下降，分別只占6.9%和6.0%。AB700414屬于Pelospora能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生丁酸和異丁酸[16]。AB699896和AB699898只在20a的低齡窖泥中檢出，均相似于Syntrophaceticus schinkii Sp3(95%，96%)，能夠氧化降解乙酸[17]。

ClusterⅥ是Thermoanaerobacteraceae類群，AB700401和AB700407均相似于Uncultured Natronoanaerobium sp.De2145 (99%，96%)，是中、高齡窖主要優(yōu)勢菌，能夠利用CO2和H2作為能源和碳源，將SO42-還原成S2-，F(xiàn)e3+還原成Fe2+[18]，進而與生成難溶性的FeS，減少乳酸亞鐵的積累和結(jié)晶，延緩窖泥老化，同時也使窖泥呈現(xiàn)烏黑色，呈現(xiàn)出老窖的特征。因此，AB700401和AB700407在窖泥老熟過程中起著重要的作用。

擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠屈撓菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Acrinobacreria)、變形菌門(Proteobacteria)和未分類細菌(Unclassified Bacteria)5個類群的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

圖 3 窖泥擬桿菌門、綠彎菌門、放線菌門、變形菌門和未分類細菌16S rDNA克隆系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of Bacteroidetes, Chloroflexi, Acrinobacreria, Proteobacteria and unclassified bacteria clones from pit mud

擬桿菌門(Bacteroidetes)僅次于厚壁菌門的第二大類群，占克隆子數(shù)的21.4%。保括Alkaliflexus、Petrimonas、Proteiniphilum和Unclassified Bacteria。AB699891在3個窖齡窖泥中均有分布，是20a窖齡窖泥優(yōu)勢菌，相似于紫單胞菌屬Petrimonas sulfuriphila BN3(99%)，能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙酸、CO2和H2，將S還原成H2S[19]，低齡窖白酒中H2S含量一般較高，與此菌代謝有一定關(guān)系。AB699892是20a窖泥優(yōu)勢菌，相似于Uncultured Porphyromonadaceae bacterium clone H-170(97%)，屬于Proteiniphilum，能夠產(chǎn)生乙酸和丙酸[20]。

綠彎菌門(Chloroflexi)含有2個OTUs，占克隆數(shù)量的4.8%。AB700397為50a窖齡窖泥優(yōu)勢菌，相似于Uncultured Longilinea sp.145(99%)，能分解果膠、果糖等碳水化合物，為產(chǎn)甲烷菌提供H2原料[21]。

放線菌門(Actinobacteria)僅含有1個OTU，占克隆數(shù)量的3.8%。AB700403相似于Uncultured Actinobacterium De210(99%)，僅在中、高齡窖泥中檢出，張肖克等[22]研究發(fā)現(xiàn)，隨窖泥不斷老熟，放線菌不斷遞增。該相似菌株的功能未見報道，而且傳統(tǒng)觀點認為放線菌在釀酒中的作用不大，不過曹蘭蘭等[23]從鹽湖中分離了14株產(chǎn)酯酶的放線菌，而酯酶對于濃香型白酒中的主體香味物質(zhì)酯類的產(chǎn)生起著重要的作用，因此，應(yīng)加強窖泥放線菌的分離和功能研究。

變形菌門(Proteobacteria)和未分類細菌(Unclassified Bacteria)所占比例很小，分別為1.0%和3.9%。

3 討 論

經(jīng)過對16S rDNA克隆文庫的統(tǒng)計分析，厚壁菌門(Firmicute)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為窖泥兩大優(yōu)勢菌群，分別占65.1%、21.4%。在對不同窖齡窖泥主要優(yōu)勢菌的分析中，發(fā)現(xiàn)不同窖齡的優(yōu)勢菌群有很大差異，低齡(20a)窖泥優(yōu)勢菌為Syntrophomonas、Petrimonas和Proteiniphilum，從代謝特征分析，三者均是產(chǎn)乙酸細菌，它們在中齡(50a)、高齡(150a)窖泥中顯著減少，窖泥浸出液檢測結(jié)果也表明乙酸和乙酸乙酯在低齡窖泥中的含量明顯高于中、高齡窖泥[24]，乙酸含量過高，會掩蓋酒體主體香，導(dǎo)致濃香味不突出。而中齡(50a)、高齡(150a)窖泥優(yōu)勢菌為Natronoanaerobium和Unclassified Clostrida，兩者在系統(tǒng)發(fā)育樹上相聚較近，其代謝產(chǎn)物對白酒的風(fēng)味的貢獻似乎不大，推測它們是老熟窖泥穩(wěn)定環(huán)境的維護者，是窖泥老熟的重要標志之一。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果表明，窖泥中優(yōu)勢細菌是芽孢桿菌屬(Bacillus)和芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus)[25]，與本次克隆結(jié)果并不一致，這可能是由于窖泥未培養(yǎng)微生物較多(73.9%)，而人工培養(yǎng)改變了窖泥微生物的原始生長環(huán)境，從而導(dǎo)致了某些可培養(yǎng)細菌在培養(yǎng)基中的反復(fù)頻繁出現(xiàn)，這與馬鳴超等[26]結(jié)論一樣，即人工分離培養(yǎng)得到的優(yōu)勢菌并不一定是真正生態(tài)學(xué)意義上的優(yōu)勢菌。另一方面，在構(gòu)建16S rDNA克隆文庫時，引物的“通用性”是相對的，因此，要結(jié)合多種方法，才能全面客觀地了解不同窖齡細菌的生態(tài)分布。本課題組擬利用獲得的細菌克隆序列信息，設(shè)計一系列引物探針，利用實時熒光定量PCR儀進一步檢測不同窖齡窖泥的優(yōu)勢菌和特征菌含量，并結(jié)合PCR-DGGE圖譜，構(gòu)建窖泥細菌分子指紋圖譜和相關(guān)數(shù)學(xué)模型。

不同窖齡窖泥細菌的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)在2.39～2.86之間，20a窖泥細菌多樣性指數(shù)最低，可能是引起低齡窖酒質(zhì)口感單薄的重要原因之一，而中、高齡窖泥微生物的多樣性較高，微生物產(chǎn)生的香味物質(zhì)也越多，其香氣就更濃郁、酒體也會醇厚飽滿。不同窖齡窖泥細菌群落相似性系數(shù)0.465～0.708之間，50a和150a窖齡的群落結(jié)構(gòu)較為相似，這說明窖泥中的細菌過50a漫長的馴化和演替，其微生物群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，所產(chǎn)生的香味成分也趨于穩(wěn)定和協(xié)調(diào)，人們常說“千年老窖萬年糟，酒好全憑窖池老”，也就是這個原因。

由此可見，通過16S rDNA克隆文庫技術(shù)系統(tǒng)地認識了不同窖齡窖泥細菌群落的基本構(gòu)成及演替規(guī)律，揭示了不同窖齡窖泥細菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性與窖泥性狀、所產(chǎn)酒質(zhì)的關(guān)系，為窖泥質(zhì)量標準的建立奠定了基礎(chǔ)。

[1] 余有貴, 李偵, 熊翔, 等. 窖泥微生態(tài)的主要特征研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(21)： 258-261.

[2] 王海英, 張文學(xué), 施思. 水井坊窖底泥微生物群落結(jié)構(gòu)的DGGE分析[J]. 中國釀造, 2012, 31(2)： 38-40.

[3] 張文學(xué), 喬宗偉, 胡承, 等. PCR技術(shù)對濃香型白酒糟醅細菌菌群的解析[J]. 四川大學(xué)學(xué)報： 工程科學(xué)版, 2005, 37(5)： 82-87.

[4] CEBRON A, COCI M, GARNIER J, et al. Denaturing gradient gel electrophoretic analysis of ammoniaoxidizing bacterial community structure in the lower Seine River： impact of Paris wastewater effluents[J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(11)： 6726-6737.

[5] 柏耀輝, 孫慶華, 溫東輝. 分子生態(tài)技術(shù)在微生物硝化及反硝化研究中的應(yīng)用[J]. 北京大學(xué)學(xué)報： 自然科學(xué)版, 2011, 47(2)： 378-384.

[6] ULRICH A, BECKER R. Soil parent material is a key determinant of the bacterial community structure in arable soils[J]. FEMS Microbiol Ecol, 2006, 56(3)： 430-443.

[7] 施思, 張文學(xué), 鄧宇, 等. 用DGGE 技術(shù)構(gòu)建白酒釀造微生物指紋圖譜的初步研究[J]. 中國釀造, 2010(1)： 118-120.

[8] GOOD I J. The population frequencies of species and the estimation of population parameters[J]. Biometrika, 1953, 40： 237-264.

[9] DRANCOURT M, BOLLET C, CARLIOZ A, et al. 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38： 3623-3630.

[10] LIU Jingjing, WU Weixiang, CHEN Chongjun, et al. Prokaryotic diversity, composition structure, and phylogenetic analysis of microbial communities in leachate sediment ecosystems[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 91(6)： 1659-1675.

[11] CHEESEMAN S L, HIOM S J, WEIGHTMAN A J, et al. Phylogeny of oral asaccharolytic Eubacterium species determined by 16S ribosomal DNA sequence comparison and proposal of Eubacterium infimum sp. nov. and Eubacterium tardum sp. nov.[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 1996, 46(4)： 957-959.

[12] TAKII S, HANADA S, TAMAKI H, et al. Dethiosulfatibacter aminovorans gen. nov., sp. nov., a novel thiosulfate-reducing bacterium isolated from coastal marine sediment via sulfate-reducing enrichment with Casamino acids[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 2007, 57(10)： 2320-2326.

[13] KENCALY W R, CAO Y, WEIMCR P J. Production of caproic acid by cocultures of ruminal cellulolytic bacteria and Clostridium kluyveri grown on cellulose and ethanol[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1995, 44： 507-513.

[14] 吳衍庸. 瀘型梭菌己酸發(fā)酵應(yīng)用的理論與實踐[J]. 釀酒科技, 2007(11)： 131-133.

[15] ZHANG Chunyang, LIU Xiaoli, DONG Xiuzhu. Syntrophomonas curvata sp. nov., an anaerobe that degrades fatty acids in co-culture with methanogens[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 2004, 54(3)： 969-973.

[16] MATTHIES C, SPRINGER N, LUDWIG W, et al. Pelospora glutarica gen. nov., sp. nov., a glutarate-fermenting, strictly anaerobic, spore-forming bacterium[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 2000, 50(2)： 645-648.

[17] WESTERHOLM M, ROOS S, SCHNüRER A. Syntrophaceticus schinkii gen. nov., sp. nov., an anaerobic, syntrophic acetate-oxidizing bacterium isolated from a mesophilic anaerobic filter[J]. FEMS Microbiol Letters, 2010, 309(1)： 100-104.

[18] KAKSONEN A H, PLUMB J J, ROBERTSON W J, et al. Novel thermophilic sulfate-reducing bacteria from a geothermally active underground mine in Japan[J]. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(5)： 3759-3762.

[19] GRABOWSKI A, TINDALL B J, BARDIN V, et al. Petrimonas sulfuriphila gen. nov., sp. nov., a mesophilic fermentative bacterium isolated from a biodegraded oil reservoir[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 2005, 55(3)： 1113-1121.

[20] CHEN Shuangya, DONG Xiuzhu. Proteiniphilum acetatigenes gen. nov., sp. nov., from a UASB reactor treating brewery wastewater[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 2005, 55(6)： 2257-2261.

[21] YAMADA T, IMACHI H, OHASHI A, et al. Bellilinea caldifistulae gen. nov., sp. nov. and Longilinea arvoryzae gen. nov., sp. nov., strictly anaerobic, filamentous bacteria of the phylum Chloroflexi isolated from methanogenic propionate-degrading consortia[J]. Int J Sys Evol Microbiol, 2007, 57(10)： 2299-2306.

[22] 張肖克, 黃永光, 胡曉瑜. 窖泥糟醅發(fā)酵過程微生物多態(tài)性特征[J]. 釀酒科技, 2006(1)： 65-72.

[23] 曹蘭蘭, 王蕓, 唐蜀昆. 新疆哈密地區(qū)鹽湖放線菌的多樣性及其功能酶的篩選[J]. 微生物學(xué)報, 2009, 49(3)： 287-293.

[24] 衛(wèi)春會, 甄攀, 羅惠波. 等. 采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對不同窖齡窖泥浸出液的分析研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2011, 32(2)： 95-97.

[25] 岳元媛, 張文學(xué), 劉霞. 濃香型白酒窖泥中兼性厭氧細菌的分離鑒定[J]. 微生物學(xué)通報, 2007, 34(2)： 251-255.

[26] 馬鳴超, 姜昕, 李俊. 應(yīng)用16SrDNA克隆文庫解析人工快速滲濾系統(tǒng)細菌種群多樣性[J]. 微生物學(xué)通報, 2008, 35(5)： 731-736.