宋詩(shī)清，袁 霖,張曉鳴,*，劉 芳

(1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

隨著我國(guó)食品工業(yè)的迅猛發(fā)展以及人們生活水平的日益提高，食品對(duì)人們來(lái)說(shuō)已不僅是裹腹的作用，而是要以先進(jìn)的工藝、繁多的品種和優(yōu)良的質(zhì)量來(lái)滿足其對(duì)食品色、香、味的新要求，并應(yīng)逐步向天然、營(yíng)養(yǎng)、衛(wèi)生、方便、可口的方向發(fā)展。調(diào)味品中的香精香料就是以改善、增加和模仿食品的香氣和香味為主要目的的食品添加劑，它為消費(fèi)者提供了香氣襲人的含香物質(zhì)和美味誘人的呈味物質(zhì)。肉味香精是近年來(lái)快速發(fā)展起來(lái)的食用香精之一，包括牛肉香精、雞肉香精、豬肉香精、各類(lèi)海鮮香精等，此類(lèi)香精能賦予肉制品以良好的風(fēng)味，主要用于方便面調(diào)味包、肉制品、調(diào)味品、休閑食品、膨化食品、速凍調(diào)理食品以及動(dòng)物飼料和寵物食品等。動(dòng)物脂肪是動(dòng)物肉類(lèi)特征風(fēng)味的主要來(lái)源[1-4]，利用酶解、控制氧化、Maillard反應(yīng)等技術(shù)處理的動(dòng)物脂肪制作肉味香精的研究已有較多的報(bào)道，借助先進(jìn)儀器分析出各種肉香成分后，運(yùn)用現(xiàn)代科技將酶解、調(diào)香、超臨界萃取、微膠囊包埋以及烹飪呈味等技術(shù)綜合運(yùn)用于香精的生產(chǎn)，通過(guò)調(diào)香生產(chǎn)出具有各種肉香和肉味的香精也有較多的闡述[5-8]。雞肉香精作為國(guó)際市場(chǎng)上用途最為廣泛的咸味香精之一，其特征風(fēng)味不足一直是香精研究的難題。研究[9-10]表明，將動(dòng)物脂肪氧化降解后加入反應(yīng)體系，可以使肉類(lèi)特征風(fēng)味更加突出。然而脂肪的氧化程度對(duì)特征風(fēng)味形成的影響程度仍不明確。本課題組[11-12]在前期牛肉香精、羊肉香精等關(guān)鍵技術(shù)成果總結(jié)分析的基礎(chǔ)上，基于雞肉特征香味形成機(jī)制亟待深入探討與明晰的需要，著重研究雞脂的酶解對(duì)雞肉風(fēng)味前體物形成的影響，首先以過(guò)氧化值(POV)和酸值(AV)為指標(biāo)，考察雞脂經(jīng)脂肪酶單獨(dú)酶解及先酶解后氧化的氧化規(guī)律；然后采用定量感官分析比較酶解雞脂、酶解-溫和加熱控制氧化雞脂及高溫控制氧化雞脂對(duì)熱反應(yīng)雞肉香精風(fēng)味形成的影響；再次結(jié)合固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜(SPME/GC-MS)分析技術(shù)對(duì)不同預(yù)處理雞脂的主要揮發(fā)性風(fēng)味組分進(jìn)行剖析，探討不同預(yù)處理方式對(duì)雞脂氧化形成特征風(fēng)味前體的影響，最終為制備雞肉特征香味突出、脂香濃郁、風(fēng)味飽滿和柔和的雞肉香精確定雞脂氧化工藝條件，同時(shí)為通過(guò)“脂肪控制氧化-美拉德熱反應(yīng)”法制備肉味香精提供一定的參考，這對(duì)進(jìn)一步提高我國(guó)肉味香精質(zhì)量，增加在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力，促進(jìn)相關(guān)食品工業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精煉雞脂(未添加任何添加劑，POV 6.16meq/kg，AV 0.78mg KOH/g) 安徽牧洋油脂有限公司；脂肪酶(Lipase MER，7500 LU/g) 日本天野酶制劑株式會(huì)社。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫代硫酸鈉、重鉻酸鉀、可溶性淀粉、水楊酸、氫氧化鉀、冰醋酸、95%乙醇、無(wú)水乙醚、無(wú)水乙醇等(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204-S型分析天平、pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；超級(jí)循環(huán)恒溫水浴鍋 上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DW-1增力無(wú)極恒速攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司；WMZK-01型溫度指示控制儀 上海飛龍儀表電器有限公司；75μm CAR/PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司；Trace MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Finnigan質(zhì)譜公司。

1.3 雞脂肪預(yù)處理

1.3.1 酶解處理

原料雞脂→加入磷酸緩沖溶液(pH6)配制成一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液(底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%)→溫度調(diào)節(jié)至40℃→添加脂肪酶(脂肪酶添加量分別為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%)進(jìn)行酶解反應(yīng)(酶解時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h)→90℃滅酶5min→降溫冷卻。冷卻并靜置分層，取上層雞脂層用于分析測(cè)定POV和AV。每個(gè)樣品重復(fù)制備2次。

1.3.2 雞脂酶解-溫和加熱控制氧化

在裝有電動(dòng)攪拌器、水銀溫度計(jì)和回流冷凝管的250mL四口燒瓶中加入酶解完全的雞脂，加熱使其溶化并攪拌。固定反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時(shí)間3h、壓縮空氣流速60L/h。待反應(yīng)結(jié)束，將雞脂取出，冷卻并靜置分層，取上層雞脂層用于分析測(cè)定POV和AV。每個(gè)樣品重復(fù)制備2次。

1.3.3 雞脂高溫加熱控制氧化

在裝有電動(dòng)攪拌器、水銀溫度計(jì)和回流冷凝管的250mL四口燒瓶中加入精煉雞脂，加熱使其溶化并攪拌。固定反應(yīng)溫度110℃、反應(yīng)時(shí)間1h、壓縮空氣流速25L/h。待反應(yīng)結(jié)束，將雞脂取出，冷卻并靜置分層，取上層雞脂層用于分析測(cè)定POV和AV。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

POV和AV的測(cè)定分別按照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行。

1.5 SPME/GC-MS分析

1.5.1 固相微萃取(SPME)

采用酶法酶解、酶解-溫和加熱控制氧化及高溫加熱法控制氧化的方法處理待分析的5個(gè)雞脂樣品，見(jiàn)表1。

表 1 GC-MC待檢測(cè)樣品的預(yù)處理方法Table 1 Sample pretreatment methods used in this study for GC-MS analysis

取3.0g待測(cè)雞脂放入特制的15mL頂空瓶，加入2μL的鄰二氯苯溶液0.54μg/μL做內(nèi)標(biāo)，迅速蓋封后置于預(yù)先設(shè)定溫度55℃的水浴中保溫5min，將老化的固相微萃取針插入樣品瓶中大約1cm處，頂空吸附30min后，于氣相進(jìn)樣口250℃條件下解吸2min。

1.5.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

采用DB-WAX毛細(xì)管柱(30m×0.25mm，液膜厚度0.25μm)，載氣為氦氣，流速1.8mL/min；色譜柱起始柱溫40℃，保持3min，以8℃/min升到80℃，然后以10℃/min升到230℃，保持10min；進(jìn)樣口溫度230℃，無(wú)分流進(jìn)樣，檢測(cè)器溫度230℃；電離方式為EV，電子能量70eV，離子源溫度200℃，接口溫度250℃，掃描質(zhì)量范圍33～450u。

1.5.3 揮發(fā)性化合物的定性及定量分析

測(cè)定化合物的保留指數(shù)(RI)，采用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與文獻(xiàn)檢索相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)化合物對(duì)比，對(duì)所得化合物進(jìn)行定性分析；采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，根據(jù)被測(cè)化合物和內(nèi)標(biāo)物相應(yīng)的色譜峰面積之比計(jì)算被測(cè)組分的含量。

1.5.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理由Xcalibur軟件系統(tǒng)完成，未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索，同時(shí)與NIST譜庫(kù)(107k compounds)和Wiley譜庫(kù)(320k compounds，6.0版本)相匹配。

1.6 熱反應(yīng)雞肉香精的制備及其感官分析

1.6.1 熱反應(yīng)雞肉香精的制備

將各成分(包括雞脂11.70g、L-半胱氨酸0.58g、核苷酸二鈉(I＋G) 0.58g、野味素0.98g、VB10.98g、VC 0.49g、葡萄糖4.88g、L-蛋氨酸0.68g、味精5.55g、白砂糖5.55g、去離子水37.82g、酵母精2.93g、雞肉酶解物27.29g)混合均勻后置于定制Maillard反應(yīng)瓶?jī)?nèi)，密封，在預(yù)定溫度100℃條件下，反應(yīng)1h后停止，冷卻，取樣評(píng)香，進(jìn)行感官分析。

1.6.2 熱反應(yīng)雞肉香精的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

采用定量感官描述分析法對(duì)熱反應(yīng)雞肉香精的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，感官評(píng)價(jià)小組由8位評(píng)價(jià)人員(23～45歲，5位女性和3位男性)組成，取樣測(cè)試前讓評(píng)價(jià)人員熟悉待測(cè)樣品的風(fēng)味特性與強(qiáng)度，討論習(xí)慣性描述的詞匯，確定雞肉香精的評(píng)價(jià)特征包括雞肉特征香氣、肉香味、脂肪香氣、香氣仿真度、圓潤(rùn)感。評(píng)價(jià)人員對(duì)不同預(yù)處理雞脂美拉德產(chǎn)物各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。每個(gè)樣品重復(fù)評(píng)價(jià)3次，取平均值。

表 2 美拉德產(chǎn)物評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of Maillard reaction products

2 結(jié)果與分析

2.1 雞脂酶解-氧化規(guī)律的研究

2.1.1 加酶量對(duì)雞脂酶解和酶解-溫和加熱控制氧化規(guī)律的影響

由圖1可知，隨著脂肪酶添加量的增加，酶解雞脂的POV變化不顯著；而隨著脂肪酶添加量由0.01%增加至0.03%時(shí)，酶解-溫和加熱控制氧化雞脂的POV呈現(xiàn)顯著的增長(zhǎng)趨勢(shì)，之后再增加加酶量，POV變化趨于平緩。這可能是因?yàn)閱渭兊拿附庵荒苁闺u脂分解生產(chǎn)甘油和游離脂肪酸，但由于反應(yīng)體系缺乏氧氣參與，導(dǎo)致游離脂肪酸的進(jìn)一步水解、氧化生成過(guò)氧化物過(guò)程受阻；而在酶解之后再進(jìn)行加熱法溫和氧化，在體系中通入氧氣，使得游離脂肪酸大量斷裂、氧化生成過(guò)氧化物，導(dǎo)致POV較高。對(duì)于AV隨著脂肪酶添加量的增加，酶解雞脂以及酶解-溫和加熱控制氧化的雞脂AV值呈線性增長(zhǎng)的趨勢(shì)，如酶解-溫和加熱控制氧化，當(dāng)加酶量由0.01%上升到0.05%時(shí)，AV由23.67mg KOH/g升高到50.32mg KOH/g，可能是酶與底物比([E]/[S])偏低，酶被底物所飽和，隨著酶添加量的增加，雞脂不斷分解生成游離脂肪酸。比較單獨(dú)酶解和酶解-溫和加熱控制氧化雞脂中AV的變化，發(fā)現(xiàn)前者略大于后者。這是由于在溫和加熱控制氧化中，游離脂肪酸被進(jìn)一步水解、氧化生成過(guò)氧化物、醛類(lèi)、酮類(lèi)等非酸類(lèi)物質(zhì)，從而導(dǎo)致AV略有下降。酶解雞脂經(jīng)加熱氧化后引起游離脂肪酸大量斷裂，應(yīng)導(dǎo)致氧化后雞脂的AV顯著低于單純酶解法，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者之間的AV并不存在顯著性差異，這可能是由于氧化過(guò)程中的游離脂肪酸在分解時(shí)，既能生成醛類(lèi)、酮類(lèi)物質(zhì)，也會(huì)產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸，從而導(dǎo)致AV的增加。這一現(xiàn)象已被課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所證實(shí)[14]。

圖 1 POV、AV值隨脂肪酶添加量的變化趨勢(shì)Fig.1 Effect of lipase dosage on POV and AV values

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)雞脂酶解和酶解-溫和加熱控制氧化規(guī)律的影響

圖 2 POV、AV隨酶解時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.2 Effect of hydrolysis time on POV and AV values

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的增加，酶解和酶解-溫和加熱控制氧化雞脂的POV始終呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且在1.5～2.0h之間，POV增長(zhǎng)幅度最為明顯。比較酶解和酶解-溫和加熱控制氧化雞脂中POV的變化，后者POV遠(yuǎn)大于前者，其原因與酶添加量對(duì)雞脂酶解和酶解-溫和加熱控制氧化的POV影響類(lèi)似。對(duì)于AV，隨著酶解時(shí)間的增加，酶解雞脂以及酶解-溫和加熱控制氧化雞脂的AV均呈線性增長(zhǎng)的趨勢(shì)。其趨勢(shì)與加酶量對(duì)雞脂酶解和酶解-溫和加熱控制氧化的AV影響類(lèi)似。

2.1.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雞脂酶解和酶解-溫和加熱控制氧化的影響

圖 3 POV、AV隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)Fig.3 Effect of substrate concentration on POV and AV values

由圖3可知，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶解和酶解-溫和加熱控制氧化雞脂的POV呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，POV達(dá)到最大，繼續(xù)提高底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，POV出現(xiàn)明顯下降，如酶解-溫和加熱控制氧化中，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，POV為120.36meq/kg，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，POV下降為81.39meq/kg。酶解-溫和加熱氧化中POV的變化明顯大于單純酶解處理樣品值，其原因與加酶量和酶解時(shí)間對(duì)雞脂酶解和酶解-溫和加熱控制氧化的POV影響類(lèi)似。對(duì)于AV，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶解和酶解-溫和加熱控制氧化雞脂的AV值呈線性下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)橹久冈谟退缑嫔暇哂休^大的活性，其催化作用需要一定的水分(必需水)以維持酶分子的活性構(gòu)象，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷增加時(shí)，體系中用于維持脂肪酶構(gòu)象的水無(wú)法與酶充分接觸，故而酶的活性受到抑制，脂肪酸的生成受阻[15]。

2.2 不同雞脂處理方式對(duì)熱反應(yīng)雞肉香精風(fēng)味形成的影響

表 3 熱反應(yīng)雞肉香精的感官評(píng)定結(jié)果Table 3 Results of sensory evaluation of chicken flavoring

由表3可知，樣品2具有較好的雞肉特征香氣和肉香氣，它所代表的是酶解-溫和加熱控制氧化處理雞脂的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物。

2.3 不同氧化處理雞脂的GC-MS分析

采用SPEM法快速富集氧化雞脂的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，通過(guò)GC-MS進(jìn)行檢測(cè)分析，在不同氧化雞脂中分離鑒定出的化合物包括：20種醛類(lèi)、6種酮類(lèi)、9種醇類(lèi)、9種羧酸類(lèi)、2種烷烴和2種雜環(huán)化合物，結(jié)果見(jiàn)表4。

表 4 不同氧化處理雞脂產(chǎn)生的揮發(fā)性成分Table 4 Volatile compounds identified in oxidized chicken fat

圖 4 氧化雞脂的重要揮發(fā)性成分總含量Fig.4 Total content of important volatile compounds in oxidized chicken fat

基于比較對(duì)照的便捷性考慮，按照產(chǎn)物類(lèi)別繪制成圖4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1)醛類(lèi)物質(zhì)的含量明顯高于其他4類(lèi)化合物，這說(shuō)明醛類(lèi)是脂質(zhì)降解的主要產(chǎn)物，對(duì)于熱反應(yīng)形成特征風(fēng)味具有關(guān)鍵作用[19]。值得注意的是，樣品4和樣品5中含有更高含量的醛類(lèi)，而其Maillard反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)定結(jié)果有異味，可能是因?yàn)?種樣品中2-庚烯醛、2-辛烯醛、2-壬烯醛、2-癸烯醛、2-十一烯醛等不飽和醛類(lèi)含量明顯高于其他3種樣品含量的緣故，而樣品2中醛類(lèi)含量適中，既保證了良好的雞脂香和肉香味，又避免了氧化異味的產(chǎn)生。由此也說(shuō)明低含量的醛可以產(chǎn)生特征香味，當(dāng)某些醛類(lèi)含量過(guò)高時(shí)會(huì)產(chǎn)生氧化異味。2)樣品1和樣品5中酸類(lèi)物質(zhì)的含量最高，其中樣品1中含有大量的棕櫚酸(甲酯)，而樣品5中含有大量的短鏈脂肪酸，原因是樣品1的雞脂經(jīng)過(guò)酶解得到大量長(zhǎng)鏈脂肪酸，但是由于體系中缺乏氧氣參與，大量長(zhǎng)鏈脂肪酸無(wú)法進(jìn)一步反應(yīng)；而樣品5經(jīng)過(guò)高溫110℃通空氣氧化，原料雞脂中少量的長(zhǎng)鏈脂肪酸被大量分解成短鏈脂肪酸。另外，樣品5的酸類(lèi)物質(zhì)總含量最高，但其化學(xué)指標(biāo)AV則明顯低于其他2種氧化方法的雞脂，原因是雞脂中甘油三酯的含量達(dá)到90%以上，酶法水解氧化可以生成大量游離長(zhǎng)鏈脂肪酸，再經(jīng)過(guò)溫和加熱控制氧化后，長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)一步反應(yīng)生成揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以及少量短鏈脂肪酸；而加熱控制氧化的溫度條件下無(wú)法將甘油三酯大量裂解生成游離脂肪酸，只能與雞脂中本身存在的少量脂肪酸反應(yīng)，但由于脂肪酸與氧氣大量反應(yīng)，所以生成了大量揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以及短鏈脂肪酸。另外需要強(qiáng)調(diào)的是，引起脂肪酸敗的脂肪酸主要是C10以內(nèi)的短鏈脂肪酸，所以盡管經(jīng)過(guò)酶解的雞脂AV較高，但相比加熱法控制氧化，酶解-溫和加熱控制氧化更不易酸敗。

圖 5 氧化雞脂的重要特征性風(fēng)味物質(zhì)Fig.5 Typical volatile substances of oxidized chicken fat

由圖5針對(duì)幾種對(duì)雞肉特征風(fēng)味形成有重要貢獻(xiàn)的典型物質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：1)壬醛、2-癸烯醛、2,4-癸二烯醛和2-十一烷烯醛作為形成雞肉風(fēng)味的關(guān)鍵物質(zhì)，提供雞肉的特征香味，在5種樣品中含量具有顯著差異。其中雞脂香和肉香味較弱的樣品1和樣品3中，上述幾種化合物檢測(cè)到的含量相對(duì)也最低；而其余3組樣品中上述幾種化合物含量相對(duì)較高，熱反應(yīng)雞肉香精的雞脂香和肉香味濃郁，回味持久；2)正己醛、正辛醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃等化合物本身不具有肉香味，但是對(duì)于整體肉香味的形成有重要的貢獻(xiàn)。在感官評(píng)定最好的樣品2中，上述幾種化合物都檢測(cè)出了較高的含量，其中辛醛、雜環(huán)類(lèi)化合物2-戊基呋喃的含量明顯高于其他組分。

3 結(jié) 論

與單獨(dú)脂肪酶酶解相比，經(jīng)酶法-溫和加熱控制氧化后所得雞脂樣品的酸值變化不明顯，但是其過(guò)氧化值提高顯著。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)酶解-溫和加熱控制氧化的雞脂(氧化程度為POV 52.36meq/kg、AV 34.06mg KOH/g)參與熱反應(yīng)后，所提供的雞脂香特征風(fēng)味突出，肉香味圓潤(rùn)持久，異味降低。其中POV 52.36meq/kg、AV 34.06mg KOH/g的氧化雞脂所形成的雞肉風(fēng)味前體物含量適中，是賦予熱加工雞肉風(fēng)味的最合適風(fēng)味前體物。本實(shí)驗(yàn)成果對(duì)提升熱反應(yīng)肉味香精的風(fēng)味品質(zhì)具有重要的理論指導(dǎo)作用及實(shí)踐意義。

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