蔡天舒，王靜雪*，林 洪，孔令紅，李 萌

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品安全實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是最常見的食源性致病菌之一，其與食品行業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域的衛(wèi)生和安全休戚相關(guān)[1-3]。由于該菌廣泛存在于自然界中，所以，食品在加工、貯藏和配送的各個(gè)環(huán)節(jié)受其污染的幾率較大。由金黃色葡萄球菌所引起的細(xì)菌性中毒和細(xì)菌性感染已經(jīng)成為人們非常關(guān)注的突發(fā)性公共衛(wèi)生事件。美國(guó)疾病控制中心顯示，在美國(guó)由金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒事件數(shù)量?jī)H次于大腸埃希菌，居第2位，占細(xì)菌性食物中毒的33%，而在加拿大則占45%，在某些歐洲國(guó)家如匈牙利、芬蘭等則占食物中毒事件的50%以上，近年來(lái)，我國(guó)每年由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第4位[4]。金黃色葡萄球菌主要的感染對(duì)象有奶、肉、蛋、水產(chǎn)品等[5-6]。同時(shí)，由于奶牛感染金黃色葡萄球菌可以造成乳房炎，使得牛奶中的金黃色葡萄球菌成為主要的病原菌。食用含有該菌的食品可能會(huì)引起腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐和發(fā)燒等典型胃腸炎反應(yīng)。

噬菌體(bacteriophage，簡(jiǎn)稱phage)是能夠感染細(xì)菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱。分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體，其中烈性噬菌體可以侵入特定細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)酶作用破壞細(xì)胞壁，使細(xì)菌裂解[7]。因此，噬菌體可作為食品監(jiān)測(cè)和生物防治食源性疾病中較好的選擇。噬菌體作為一種生物抗菌劑具有針對(duì)性強(qiáng)、抗細(xì)菌耐藥性和無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)[8]。目前已有噬菌體用于食品生物防控的報(bào)道，如Listex_P100已經(jīng)作為世界上第一個(gè)通過(guò)美國(guó)食品藥品管理局(FDA)認(rèn)證的噬菌體食品添加劑，用于抑制食品中的李斯特菌[9]。因此，本研究以引起食源性疾病的主要病原菌金黃色葡萄球菌為宿主菌，分離篩選出具有特異性的金黃色葡萄球菌噬菌體，對(duì)其進(jìn)行理化和生物學(xué)特性的研究。并在此基礎(chǔ)上，研究噬菌體對(duì)巴氏殺菌牛奶中金黃色葡萄球菌的抑菌作用，為進(jìn)一步利用噬菌體控制、消除由食源性致病菌金黃色葡萄球菌引起的食品污染提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集2011年5月采集自青島市團(tuán)島污水處理廠進(jìn)水池污水，樣品置于4℃冰箱中備用。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

巴氏殺菌牛奶 市售。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、Baird-Parker培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限公司。

SM緩沖液：MgSO4·7H2O 2g、NaCl 5.8g，50mL的1mol/L Tris-HCl (pH 7.5)，加蒸餾水至1000mL。

1.1.3 菌株

金黃色葡萄球菌(ATCC6538) 北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.2 噬菌體的分離及純化

1.2.1 噬菌體的分離

將100μL對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌加入到5mL雙倍濃縮營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，在上述培養(yǎng)液中加入經(jīng)過(guò)5500r/min離心10min處理的污水5mL，于37℃、120r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日取上述培養(yǎng)液6000r/min離心10min棄去沉淀，上清液經(jīng)過(guò)0.22μm的無(wú)菌微孔濾膜除菌，得到噬菌體原液。

1.2.2 噬菌體的純化

采用雙層平板法和噬菌斑法進(jìn)行噬菌體的純化。具體操作如下：取100μL對(duì)數(shù)期的宿主菌與100μL噬菌體液加入5mL半固體培養(yǎng)基中，充分混合后倒入固體瓊脂平板上制成雙層平板，待平板冷凝后，立即將其倒置并于37℃恒溫培養(yǎng)。

在上述形成噬菌斑的雙層平板上挑取形態(tài)大小一致的單個(gè)噬菌斑，用接種針穿刺目的噬菌斑，將穿刺后帶有噬菌體的接種針伸入1mL SM培養(yǎng)液中充分混勻，并于4℃冰箱中靜置過(guò)夜。次日經(jīng)漩渦振蕩器振蕩搖勻后，取噬菌體液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，將100μL對(duì)數(shù)期金黃色葡萄球菌與100μL噬菌體稀釋液加入5mL半固體培養(yǎng)基中充分混勻后制成雙層平板，待凝固后倒置，并于37℃恒溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜，重復(fù)雙層平板純化操作5次后得到純噬菌體。

1.3 噬菌體的生理特性

1.3.1 噬菌體的電鏡觀察

采用磷鎢酸負(fù)染法，方法如下：取100μL純化增殖的噬菌體，滴在石蠟片上，將銅網(wǎng)放置于噬菌體液滴上方，5min后將銅網(wǎng)自液滴上取下置于干凈的濾紙上，晾干5min，使用2%的磷鎢酸(pH6.8)染色，10min后將銅網(wǎng)自磷鎢酸液滴上取下，晾干，將制備好的染色片在透射電鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.2 噬菌體熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取400μL 1.14×108PFU/mL的噬菌體于無(wú)菌EP管中，分別于40、50、60、70、80℃的水浴中作用20、40、60min。待作用結(jié)束后立即將樣品置于4℃冷卻，將樣品進(jìn)行適當(dāng)梯度稀釋后測(cè)定噬菌體的效價(jià)。

1.3.3 噬菌體pH值穩(wěn)定性

噬菌體pH值穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)所選取的pH值梯度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。分別取900μL不同pH值的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基到無(wú)菌EP管中，37℃水浴處理，當(dāng)溫度平衡后加入100μL的噬菌體，37℃水浴作用2h，利用雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)。

1.3.4 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI值)的測(cè)定

按照感染復(fù)數(shù)分別為1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001的比例，將噬菌體與金黃色葡萄球菌加入營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)10h，4000r/min離心15min以棄去宿主菌沉淀，上清液用0.22μm的濾膜過(guò)濾，測(cè)定此時(shí)噬菌體的效價(jià)，所對(duì)應(yīng)的效價(jià)最高的感染復(fù)數(shù)即為最佳感染復(fù)數(shù)。

1.3.5 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定采用由杜崇濤[10]、Lu[11]等改進(jìn)的方法。將純化的噬菌體和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌按照最佳感染復(fù)數(shù)為0.1的比例加入到液體培養(yǎng)基中，37℃孵育10min，12000r/min離心30s，棄上清，用營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基洗滌兩次，以去除未吸附宿主菌的游離噬菌體。然后加入37℃預(yù)熱的營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基并充分混勻，迅速置于37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在0時(shí)刻和160min之間，每隔10min取樣測(cè)定噬菌體的效價(jià)。最后以噬菌體侵染宿主菌的作用時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體的效價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線。

1.4 噬菌體在牛奶中的抑菌應(yīng)用實(shí)驗(yàn)

1.4.1 噬菌體37℃抑菌

參照Martínez等[12]的方法。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌，用生理鹽水將其濃度調(diào)整為2×107CFU/mL和1×104CFU/mL。每個(gè)濃度下金黃色葡萄球菌的抑菌實(shí)驗(yàn)分為兩組進(jìn)行，其中一組為實(shí)驗(yàn)組：取1mL菌液加入到94mL經(jīng)過(guò)巴氏殺菌的牛奶中，同時(shí)加入5mL(效價(jià)增殖至5×109PFU/mL)純化的噬菌體液，將其充分混勻；另一組為對(duì)照組：取1mL菌液加入99mL巴氏殺菌牛奶中，不添加噬菌體，充分混勻；將以上兩種經(jīng)過(guò)處理的牛奶靜置于37℃恒溫水浴作用，分別于0、1、2、3、6、9、12h取出按照GB 4789.10—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中的Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌的數(shù)量，從而檢測(cè)噬菌體的抑菌效果。

1.4.2 噬菌體4℃抑菌

噬菌體抑菌實(shí)驗(yàn)處理方法同1.4.1節(jié)所述，將經(jīng)過(guò)處理的巴氏殺菌牛奶充分混勻后，置于4℃恒溫作用，分別于0、12、24、48、72h檢測(cè)噬菌體的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離純化

從青島市團(tuán)島污水處理廠分離出一株以金黃色葡萄球菌為宿主菌的噬菌體，通過(guò)雙層平板可以觀察到噬菌斑，經(jīng)過(guò)5次純化后，該噬菌體所形成的噬菌斑形態(tài)和大小保持均勻一致，呈圓形透明，邊緣清晰，直徑約為1mm，并將該純化的噬菌體命名為qdsa001(圖1)。

圖 1 噬菌體qdsa001的噬菌斑Fig.1 Bacteriophage plaque of qdsa001

2.2 噬菌體的生理特性

2.2.1 噬菌體電鏡觀察結(jié)果

圖 2 噬菌體qdsa001電鏡圖Fig.2 TEM micrograph of qdsa001

噬菌體qdsa001增殖液經(jīng)過(guò)透射電鏡觀察，其形態(tài)如圖2所示。該金黃色葡萄球菌噬菌體為典型的T系列噬菌體，呈蝌蚪形，頭部為正多面體結(jié)構(gòu)，有細(xì)長(zhǎng)的尾部，噬菌體整個(gè)長(zhǎng)約為220nm，頭部直徑為41nm左右，尾部長(zhǎng)約180nm左右。根據(jù)2005年國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第八次報(bào)告所提出的分類準(zhǔn)則[13]，本研究所分離的噬菌體的形態(tài)符合長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)特征，為長(zhǎng)尾噬菌體。

2.2.2 噬菌體的熱穩(wěn)定性

圖 3 噬菌體的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of qdsa001

由圖3可知，噬菌體在40℃作用60min后活性基本保持不變，在50℃作用60min后噬菌體的存活率仍高達(dá)97.8%，噬菌體在60℃條件下作用40min后，其存活率仍在50%以上。因此，噬菌體在60℃條件下，仍具有較為良好的耐受性。在70℃和80℃作用下，則檢測(cè)不到噬菌體的存在，表明噬菌體基本失活。由此可見該噬菌體對(duì)60℃及其以下的溫度均具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

2.2.3 噬菌體的pH值穩(wěn)定性

圖 4 噬菌體的pH值穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of qdsa001

由圖4可知，噬菌體在pH5～9范圍內(nèi)，其效價(jià)均在108PFU/mL以上，具有穩(wěn)定和良好的裂解活性。隨著pH值的降低，噬菌體活性顯著下降，當(dāng)pH值為3時(shí)，完全失去感染宿主的能力，但其在高pH值環(huán)境下有較好的穩(wěn)定性。pH值為13時(shí)仍保持45.8%的存活率。分析表明，該噬菌體具有畏酸嗜堿的特性。

2.2.4 噬菌體最佳MOI值的測(cè)定

由表1噬菌體感染復(fù)數(shù)的結(jié)果可知，當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.1時(shí)，噬菌體感染宿主菌后產(chǎn)生子代噬菌體的效價(jià)最高，為3.5×108PFU/mL，因此，可以確定噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)是0.1。

表 1 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù) Table 1 Optimal MOI of qdsa 001

2.2.5 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

圖 5 噬菌體qdsa001一步生長(zhǎng)曲線Fig.5 One-step growth curve of qdsa001

由圖5噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線可知，噬菌體qdsa001感染宿主菌后的10min內(nèi)，噬菌體的數(shù)量幾乎保持不變，表明噬菌體qdsa001感染宿主菌的潛伏期約為10min；噬菌體侵染宿主菌后的10～100min內(nèi)，噬菌體的數(shù)量急速增加，可知噬菌體qdsa001的爆發(fā)期約90min，在隨后的60min內(nèi)，噬菌體的數(shù)量變化不大，標(biāo)志著噬菌體進(jìn)入穩(wěn)定期。根據(jù)裂解量計(jì)算公式：裂解量=爆發(fā)末期噬菌體效價(jià)/感染初期宿主菌濃度[14]，得出該噬菌體的平均裂解量為32.2。

2.3 不同溫度條件下，噬菌體在牛奶中的抑菌效果

2.3.1 37℃條件下抑菌效果

圖 6 噬菌體qdsa001在37℃巴氏殺菌牛奶中的抑菌效果Fig.6 Inactivation of Staphylococcus aureus in milk by qdsa001 at 37 ℃

噬菌體qdsa001在37℃條件下對(duì)牛奶中金黃色葡萄球菌的抑菌作用效果，如圖6所示，當(dāng)初始宿主菌為105CFU/mL時(shí)，對(duì)照組宿主菌數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在6h之后基本保持穩(wěn)定；相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中宿主菌數(shù)量則呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)，作用6h，實(shí)驗(yàn)組中宿主菌數(shù)量降至3.5(lg(CFU/mL))左右，至12h，實(shí)驗(yàn)組中宿主菌數(shù)量已降低至檢測(cè)限以下。當(dāng)初始宿主菌數(shù)量為102CFU/mL時(shí)，對(duì)照組的宿主菌數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，作用12h后增至107CFU/mL；而實(shí)驗(yàn)組在噬菌體作用下則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，作用12h后，牛奶中宿主菌數(shù)量降至檢測(cè)限以下。因此，噬菌體對(duì)牛奶中兩個(gè)不同濃度金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯。

2.3.2 4℃條件下抑菌效果

圖 7 噬菌體qdsa001在4℃巴氏殺菌牛奶中的抑菌效果Fig.7 Inactivation of Staphylococcus aureus in milk by qdsa001 at 4 ℃

由圖7可知，當(dāng)初始宿主菌數(shù)量為105CFU/mL時(shí)，對(duì)照組中宿主菌數(shù)量隨著時(shí)間的增加，幾乎無(wú)變化；實(shí)驗(yàn)組宿主菌數(shù)量呈現(xiàn)顯著地下降趨勢(shì)，作用24h后，實(shí)驗(yàn)組中宿主菌的數(shù)量降至103CFU/mL以下，至72h時(shí)降至9CFU/mL。當(dāng)牛奶中加入初始宿主菌數(shù)量為102CFU/mL時(shí)，對(duì)照組中宿主菌數(shù)量無(wú)顯著變化，而加入噬菌體的實(shí)驗(yàn)組則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，作用48h后，與對(duì)照組相比宿主菌數(shù)量下降約1.5(lg(CFU/mL))，作用72h后宿主菌數(shù)量降低至檢測(cè)限以下，表明在4℃條件下，噬菌體對(duì)牛奶中兩個(gè)不同濃度金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯。

3 討 論

金黃色葡萄球菌為最主要的食源性病原菌之一。然而，噬菌體作為一種生物抑菌劑，具有突出的優(yōu)越性，廣泛存在于自然界中，在生物圈中其數(shù)量達(dá)1031之巨[15]。同時(shí)，具有特異殺菌、不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)。因此，噬菌體對(duì)于食品中金黃色葡萄球菌的生物防控具有良好的應(yīng)用前景。國(guó)內(nèi)對(duì)金黃色葡萄球菌噬菌體已有研究，石琰璟等[16]從污水中分離和純化了以金黃色葡萄球菌為宿主菌的噬菌體，但是未涉及其生物學(xué)性質(zhì)的研究。李隴平等[17]也只是探討了金黃色葡萄球菌噬菌體的分離純化以及保存方面的研究，也并未涉及其相關(guān)生物學(xué)性質(zhì)的深入研究。本研究分離純化出一株以金黃色葡萄球菌為宿主菌的噬菌體，并對(duì)其基本理化和生物學(xué)特性進(jìn)行了分析研究。同時(shí)，利用純化好的噬菌體qdsa001對(duì)巴氏殺菌牛奶進(jìn)行抑菌效果的研究。

利用噬菌體進(jìn)行食品中的生物防控已經(jīng)有所報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)所分離得到的噬菌體qdsa001對(duì)溫度和pH值均具有較為良好的耐受能力，使其應(yīng)用于食品工業(yè)具有良好的基礎(chǔ)。特別是，調(diào)查已經(jīng)表明金黃色葡萄球菌是牛奶中的主要致病菌[18]。因此，利用噬菌體抑制牛奶中的金黃色葡萄球菌，對(duì)乳制品的發(fā)展具有十分重要的意義。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況，本研究中選取牛奶加工貯運(yùn)過(guò)程中的關(guān)鍵控制溫度37℃和4℃為研究條件，分別測(cè)定噬菌體qdsa001對(duì)牛奶中105CFU/mL與102CFU/mL的兩個(gè)不同濃度金黃色葡萄球菌的抑制作用，結(jié)果表明，噬菌體qdsa001表現(xiàn)出良好的抑菌能力，37℃作用12h后，不同濃度金黃色葡萄球菌的牛奶中宿主菌數(shù)量均降至檢測(cè)限以下；4℃條件下，噬菌體也表現(xiàn)出良好的抑菌性能，特別是對(duì)于初始菌落數(shù)為102CFU/mL的牛奶，在72h內(nèi)，可將牛奶中宿主菌數(shù)量降至檢測(cè)限以下，符合國(guó)家對(duì)于牛奶中金黃色葡萄球菌的限量要求。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所分離的噬菌體qdsa001用于生物防控是切實(shí)可行的，特別是對(duì)于牛奶在貯運(yùn)和生產(chǎn)加工過(guò)程的金黃色葡萄球菌的控制具有重要意義。因此，本研究為利用噬菌體進(jìn)行食品中的生物防控提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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