楊長友 袁中厚 鄭小敏 張濤
(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,重慶 401331)
油菜為十字花科蕓薹屬越年生或一年生植物,是世界四大油料作物之一,也是我國重要的油料作物之一,它在人類的生活和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著極其重要的作用。油菜的莖可以食用,油菜種子不僅可用來榨取食用油,還可用作飼料。同時(shí)油菜花具有一定的觀賞價(jià)值,可以用作旅游資源。另外,能源危機(jī)是當(dāng)前全球面臨的重大難題之一,由于低芥酸菜籽油中的脂肪酸碳鏈組成為16-18個(gè)碳,與柴油分子碳數(shù)相近,且油菜種植范圍廣,屬于可再生資源,油菜被認(rèn)為是生物柴油最理想的原料[1]。目前,轉(zhuǎn)基因技術(shù)在油菜育種中已獲得了廣泛的應(yīng)用,并得到了大量具有不同優(yōu)良特性的油菜種質(zhì)[2-6]。高效的植株再生體系是植物轉(zhuǎn)基因研究能否有效進(jìn)行的前提條件。經(jīng)過多年研究,國內(nèi)外許多機(jī)構(gòu)已建立了成熟的油菜離體再生體系[7-10]。然而,研究表明,油菜不同基因型、不同外植體之間的最佳離體再生條件存在差異[11-14],這在一定程度上阻礙了油菜轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展。本研究以甘藍(lán)型油菜HC8為材料,從苗齡、預(yù)培養(yǎng)基激素濃度、預(yù)培養(yǎng)天數(shù)、6-BA及NAA的濃度等方面探究該油菜品種的最佳離體再生條件,建立并優(yōu)化甘藍(lán)型油菜HC8的高頻率離體再生體系,進(jìn)一步豐富油菜離體高效再生體系的相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù),為油菜組織培養(yǎng)提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù),并為進(jìn)一步通過植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得預(yù)期優(yōu)良性狀的油菜新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)品系HC8由重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞與遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2.1 培育方法
1.2.1.1 油菜無菌苗培育 挑選飽滿、大小均勻和無病蟲害的油菜種子,用無菌蒸餾水清洗種子,用75%乙醇消毒30 s,用無菌蒸餾水沖洗3-5次,再用0.1%升汞(HgCl2)消毒8 min,之后再用無菌蒸餾水沖洗3-5次,并將種子浸泡于無菌蒸餾水中30 min以上。消毒之后將其接種于1/2 MS培養(yǎng)基上,于25-28℃、12 h光照/12 h黑暗條件下培養(yǎng)。
1.2.1.2 無菌苗苗齡對油菜外植體分化的影響 分別取培育不同天數(shù)(4、5、6和7 d)的油菜無菌苗,將子葉切成 0.5 cm2左右的小塊、下胚軸切成0.5 cm左右的小段,接種于MS+1.0 mg/L 2,4-D的預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培育5 d后,將生長良好的子葉外植體轉(zhuǎn)接入MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中、將生長良好的下胚軸外植體轉(zhuǎn)接入MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中,30 d后統(tǒng)計(jì)再生頻率和分化頻率。
1.2.1.3 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對油菜外植體分化的影響 取培育5 d的油菜無菌苗,將子葉切成 0.5 cm2左右的小塊、下胚軸切成0.5 cm左右的小段,接種于MS+1.0 mg/L 2,4-D的預(yù)培養(yǎng)基上,分別預(yù)培育3、4、5和6 d后,取相應(yīng)預(yù)培育天數(shù)生長良好的子葉外植體轉(zhuǎn)接入MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中、生長良好的下胚軸外植體轉(zhuǎn)接入MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中,30 d后統(tǒng)計(jì)再生頻率和分化頻率。
1.2.1.4 預(yù)培養(yǎng)基中不同濃度2,4-D對油菜外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響 取培育5 d的油菜無菌苗,將子葉切成 0.5 cm2左右的小塊、下胚軸切成0.5 cm左右的小段,接種于含有不同濃度2,4-D的MS培養(yǎng)基上,預(yù)培育5 d后,將生長良好的子葉外植體轉(zhuǎn)接入MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中、生長良好的下胚軸外植體轉(zhuǎn)接入MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中,15 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率,30 d后統(tǒng)計(jì)再生頻率和分化頻率。
1.2.1.5 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同濃度6-BA及NAA對油菜外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響 取培育5 d的油菜無菌苗,將子葉切成 0.5 cm2左右的小塊、下胚軸切成0.5 cm左右的小段,接種于MS+1.0 mg/L 2,4-D的預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培育5 d后,將生長良好的外植體(子葉、下胚軸)轉(zhuǎn)接入含有不同濃度6-BA和NAA的分化培養(yǎng)基中,15 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率,30 d后統(tǒng)計(jì)再生頻率和分化頻率。
1.2.1.6 生根培養(yǎng)基中不同濃度NAA對油菜苗生根的影響 取生長到 2-3 cm 的不定芽,接種到含不同濃度NAA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。20 d后統(tǒng)計(jì)生根率和平均得根數(shù)。
1.2.2 培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件 無菌苗萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2 MS;預(yù)培養(yǎng)基為MS+2,4-D(0.5、1.0和1.5 mg/L);愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA(1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/L)+NAA(0、0.05、0.1、0.2和0.3 mg/L)+3.5 mg/L AgNO3,共25個(gè)處理,芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分相同;生根培養(yǎng)基為MS+NAA(0、0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 mg/L)。所有培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30 g/L、瓊脂濃度為7 g/L,pH為5.8-6.0,培養(yǎng)溫度為25-28℃,光照條件為12 h光照/12 h黑暗。
1.2.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析方法 試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),每個(gè)處理重復(fù)3次,接種后每隔2 d觀察外植體的變化。試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析,平均數(shù)之間差異顯著性比較采用LSD法,柱形圖和折線圖均在Excel2003電子表格下制作。
愈傷誘導(dǎo)率(%)=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%
再生頻率(%)=長芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)× 100%
分化頻率(%)=再生不定芽總數(shù)/接種外植體總數(shù)× 100%
生根率(%)=長根的苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%
不同苗齡的油菜外植體(子葉、下胚軸)的再生頻率及分化頻率存在一定差異。在油菜苗齡為5 d時(shí),子葉、下胚軸的再生頻率及分化頻率均達(dá)到最大,子葉的再生頻率及分化頻率分別為85.26%和100%;下胚軸的再生頻率及分化頻率分別為80.85%和96.75%。
預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對油菜外植體的再生頻率及分化頻率均表現(xiàn)有不同程度的影響。預(yù)培養(yǎng)的子葉和下胚軸的分化效果較好,分化頻率分別為80.20%和83.0%。方差分析結(jié)果表明,預(yù)培養(yǎng)5 d后子葉和下胚軸的分化頻率與其他預(yù)培養(yǎng)天數(shù)的相比差異顯著,而再生頻率與其他天數(shù)的相差不大。因此預(yù)培養(yǎng)5 d有利于油菜外植體的分化。
油菜外植體經(jīng)不同濃度2,4-D處理后的分化情況存在顯著差異。當(dāng)2,4-D濃度為1.0 mg/L-1時(shí),子葉、下胚軸的再生頻率均達(dá)到最大,分別為87.52%和80.15%;二者的分化頻率也均為最大,分別為120.50%和102.45%。
在不同激素組合處理?xiàng)l件下,油菜外植體愈傷組織形成情況差異較大。子葉在6-BA(1.0、2.0、3.0和4.0 mg/L) + NAA(0.05和0.1 mg/L)8個(gè)激素組合處理?xiàng)l件下,愈傷組織形成情況較好,愈傷組織生長較快(圖1-A);下胚軸在6-BA(1.0、2.0、3.0和4.0 mg/L)+NAA 0.05 mg/L 4個(gè)激素組合處理?xiàng)l件下,愈傷組織形成情況較好,愈傷組織生長較快(圖1-B)。同時(shí),從圖2中可以看出,在6-BA濃度為1-4 mg/L、NAA濃度為0.05-0.1 mg/L條件下,子葉愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)到100%;下胚軸在6-BA濃度為1-4 mg/L、NAA濃度為0.05 mg/L條件下,愈傷誘導(dǎo)率在90.0%左右。因此,油菜子葉愈傷組織誘導(dǎo)的適宜6-BA濃度為1-4 mg/L,適宜NAA濃度為0.05-0.1 mg/L;下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的適宜6-BA濃度為1-4 mg/L,適宜NAA濃度為0.05 mg/L。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同濃度6-BA及NAA對油菜愈傷組織分化的影響也較大。在本研究所設(shè)的激素條件下,子葉愈傷組織在大多數(shù)激素組合條件下均可分化出不定芽(圖1-C),下胚軸愈傷組織在部分激素組合條件下也可分化出不定芽(圖1-D)。而在有些激素組合條件下,雖可誘導(dǎo)愈傷組織形成,但不能誘導(dǎo)芽的形成。
由圖3可知,在2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA及3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的組合條件下子葉愈傷組織的再生頻率和分化頻率均較高,兩者的再生頻率分別為88.0%和83.33%,兩者的分化頻率分別為104.0%和108.33%。方差分析結(jié)果表明,以上兩個(gè)激素組合條件下子葉愈傷組織的再生頻率及分化頻率差異均不顯著。從圖4可以看出,在4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA的組合條件下下胚軸愈傷組織的再生頻率和分化頻率均為最高,分別為81.82%和104.55%,且與其他組合差異較大。因此,油菜子葉愈傷組織不定芽誘導(dǎo)的最佳激素組合為2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA及3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA,油菜下胚軸愈傷組織不定芽誘導(dǎo)的最佳激素組合為4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。
不同濃度NAA條件下油菜苗的生根率及平均得根數(shù)如圖5所示。與不施加NAA的條件相比,施加NAA可以顯著影響油菜苗的生根情況,而且不同NAA濃度下的油菜苗生根情況也存在差異,當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)油菜苗的生根率及平均得根數(shù)均達(dá)到最大值,分別為90.0%和21.6(根)。另外,在0.5 mg/L NAA條件下,油菜苗生根較快,根較粗,根系較發(fā)達(dá)(圖1-D)。因此,油菜苗生根的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA。
本研究表明,較高的6-BA濃度及較低的NAA濃度有利于油菜愈傷組織的誘導(dǎo)及分化,這與前人的研究結(jié)果類似[15]。然而通過比較發(fā)現(xiàn),子葉和下胚軸對不同濃度6-BA及NAA的敏感性存在一定差異,下胚軸比子葉更為敏感。這可能是由于子葉和下胚軸的內(nèi)源激素含量存在差異以及兩者對外源激素的吸收能力不同,具體原因有待進(jìn)一步研究。另外,誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入AgNO3是為了促進(jìn)油菜愈傷組織形成不定芽。在愈傷組織形成過程中外植體會產(chǎn)生大量乙烯,而乙烯對芽的形成有一定的抑制作用,Ag+可與乙烯競爭作用部位,減弱乙烯的抑制作用,從而間接地促進(jìn)油菜愈傷組織形成不定芽,提高油菜再生頻率及分化頻率[16,17]。已有研究表明[7,8,18],促進(jìn)油菜愈傷組織形成不定芽的適宜AgNO3濃度為5 mg/L。由于品種差異,本試驗(yàn)的AgNO3濃度選擇為3.5 mg/L。
本試驗(yàn)通過對甘藍(lán)型油菜HC8的離體再生研究,成功建立了油菜HC8的高效離體再生體系。其組織培養(yǎng)最佳苗齡為5 d;最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為5 d,最適2,4-D濃度為1.0 mg/L;子葉最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3或MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3;下胚軸最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3;最佳生根培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA。
[1] 曾偉萍, 肖彌彰, 王國槐.油菜作為生物柴油原料的研究進(jìn)展[J].作物研究, 2007, 5:453-455.
[2] Voelker TA, Worrell AC, Anderson L. Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains in transgenic oilseed plants[J]. Science, 1992, 257(5066):72-74.
[3] Jones A, Mavies HM, Voelker TA. Palmitoyl-acyl carrier protein(ACP)thioesterase and the evolutionary origin of plant acyl - ACP thioesterase[J]. Plant Cell, 1995, 7(3):359-371.
[4] 王景雪, 趙福永, 徐培林, 等.油菜轉(zhuǎn)抗草甘膦、抗蟲基因獲得雙抗植株[J].遺傳學(xué)報(bào), 2006, 32(12):1293-1300.
[5] 韓德俊, 陳耀鋒, 李春蓮, 等.轉(zhuǎn)甜菜堿醛脫氫酶基因油菜的獲得及其耐鹽性研究[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究, 2007, 25(4):6-11.
[6] 付紹紅, 張汝全, 牛應(yīng)澤. Floral-dip轉(zhuǎn)化法將PEPC基因ihpRNA干擾表達(dá)載體導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2009, 25(8):764-769.
[7] 王艷, 曾幼玲, 張富春, 等.新疆甘藍(lán)型油菜下胚軸的組織培養(yǎng)和植株再生研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 42(1):24-28.
[8] 劉海燕, 隆小華, 劉兆普.南鹽油1號油菜的組織培養(yǎng)及植株再生研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(3):59-61.
[9] 裴冬麗.白菜型油菜高效離體再生體系的建立[J].北方園藝, 2011(1):127-129.
[10] 夏鴻亮, 汪洪.滬油16 號油菜的組織培養(yǎng)和植株再生[J].種子, 2011, 30(10):92-93.
[11] Pua EC, Asha MP, Nagy F, et al. Transgenic plants of Brassica napus L.[J]. Nature Biotechnology, 1987, 5:815-817.
[12] Damgaard O, Rasmussen O. Direct regeneration of transformed shoots in Brassica napus from hypocotyl infections with Agrobacterium rhizogenes[J]. Plant Molecule Biology, 1991, 17:1-8.
[13] Ovesna J, Ptacek L, Opatrny Z. Factor influencing the regeneration capacity of oilseed rape and cauliflower in transformation experiments[J]. Biologia Plantarum, 1993, 35(1):107-112.
[14] 田志宏, 孟金陵.甘藍(lán)型油菜原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生的研究[J].中國油料作物學(xué)報(bào), 2002, 24(2):10-13.
[15] 許本波, 謝伶俐, 田志宏, 等.分化培養(yǎng)基和抗生素對甘藍(lán)型黃子油菜轉(zhuǎn)化效率的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 46(4):500-503.
[16] 張鵬, 凌定厚.提高菜心離體植株再生頻率的研究[J].植物學(xué)報(bào), 1995, 37(11):902-908.
[17] 張鵬, 傅愛根, 王愛國. AgNO3在植物離體培養(yǎng)中的作用及可能的機(jī)制[J].植物生理學(xué)通訊, 1997, 33(5):376-379.
[18] 邢德峰, 李新玲, 王全偉, 等.影響大白菜高效離體培養(yǎng)再生的因素[J].植物生理學(xué)通訊, 2008, 39(5):420-424.