楊長友 袁中厚 鄭小敏 張濤

（重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331）

油菜為十字花科蕓薹屬越年生或一年生植物，是世界四大油料作物之一，也是我國重要的油料作物之一，它在人類的生活和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著極其重要的作用。油菜的莖可以食用，油菜種子不僅可用來榨取食用油，還可用作飼料。同時(shí)油菜花具有一定的觀賞價(jià)值，可以用作旅游資源。另外，能源危機(jī)是當(dāng)前全球面臨的重大難題之一，由于低芥酸菜籽油中的脂肪酸碳鏈組成為16-18個(gè)碳，與柴油分子碳數(shù)相近，且油菜種植范圍廣，屬于可再生資源，油菜被認(rèn)為是生物柴油最理想的原料［1］。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在油菜育種中已獲得了廣泛的應(yīng)用，并得到了大量具有不同優(yōu)良特性的油菜種質(zhì)［2-6］。高效的植株再生體系是植物轉(zhuǎn)基因研究能否有效進(jìn)行的前提條件。經(jīng)過多年研究，國內(nèi)外許多機(jī)構(gòu)已建立了成熟的油菜離體再生體系［7-10］。然而，研究表明，油菜不同基因型、不同外植體之間的最佳離體再生條件存在差異［11-14］，這在一定程度上阻礙了油菜轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展。本研究以甘藍(lán)型油菜HC8為材料，從苗齡、預(yù)培養(yǎng)基激素濃度、預(yù)培養(yǎng)天數(shù)、6-BA及NAA的濃度等方面探究該油菜品種的最佳離體再生條件，建立并優(yōu)化甘藍(lán)型油菜HC8的高頻率離體再生體系，進(jìn)一步豐富油菜離體高效再生體系的相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為油菜組織培養(yǎng)提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)，并為進(jìn)一步通過植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得預(yù)期優(yōu)良性狀的油菜新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）品系HC8由重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞與遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 培育方法

1.2.1.1 油菜無菌苗培育 挑選飽滿、大小均勻和無病蟲害的油菜種子，用無菌蒸餾水清洗種子，用75%乙醇消毒30 s，用無菌蒸餾水沖洗3-5次，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒8 min，之后再用無菌蒸餾水沖洗3-5次，并將種子浸泡于無菌蒸餾水中30 min以上。消毒之后將其接種于1/2 MS培養(yǎng)基上，于25-28℃、12 h光照/12 h黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2.1.2 無菌苗苗齡對油菜外植體分化的影響 分別取培育不同天數(shù)（4、5、6和7 d）的油菜無菌苗，將子葉切成 0.5 cm2左右的小塊、下胚軸切成0.5 cm左右的小段，接種于MS+1.0 mg/L 2，4-D的預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培育5 d后，將生長良好的子葉外植體轉(zhuǎn)接入MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中、將生長良好的下胚軸外植體轉(zhuǎn)接入MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計(jì)再生頻率和分化頻率。

1.2.1.3 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對油菜外植體分化的影響 取培育5 d的油菜無菌苗，將子葉切成 0.5 cm2左右的小塊、下胚軸切成0.5 cm左右的小段，接種于MS+1.0 mg/L 2，4-D的預(yù)培養(yǎng)基上，分別預(yù)培育3、4、5和6 d后，取相應(yīng)預(yù)培育天數(shù)生長良好的子葉外植體轉(zhuǎn)接入MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中、生長良好的下胚軸外植體轉(zhuǎn)接入MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計(jì)再生頻率和分化頻率。

1.2.1.4 預(yù)培養(yǎng)基中不同濃度2，4-D對油菜外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響 取培育5 d的油菜無菌苗，將子葉切成 0.5 cm2左右的小塊、下胚軸切成0.5 cm左右的小段，接種于含有不同濃度2，4-D的MS培養(yǎng)基上，預(yù)培育5 d后，將生長良好的子葉外植體轉(zhuǎn)接入MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中、生長良好的下胚軸外植體轉(zhuǎn)接入MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基中，15 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，30 d后統(tǒng)計(jì)再生頻率和分化頻率。

1.2.1.5 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同濃度6-BA及NAA對油菜外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響 取培育5 d的油菜無菌苗，將子葉切成 0.5 cm2左右的小塊、下胚軸切成0.5 cm左右的小段，接種于MS+1.0 mg/L 2，4-D的預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培育5 d后，將生長良好的外植體（子葉、下胚軸）轉(zhuǎn)接入含有不同濃度6-BA和NAA的分化培養(yǎng)基中，15 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，30 d后統(tǒng)計(jì)再生頻率和分化頻率。

1.2.1.6 生根培養(yǎng)基中不同濃度NAA對油菜苗生根的影響 取生長到 2-3 cm 的不定芽，接種到含不同濃度NAA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。20 d后統(tǒng)計(jì)生根率和平均得根數(shù)。

1.2.2 培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件 無菌苗萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2 MS；預(yù)培養(yǎng)基為MS+2，4-D（0.5、1.0和1.5 mg/L）；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA（1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/L）+NAA（0、0.05、0.1、0.2和0.3 mg/L）+3.5 mg/L AgNO3，共25個(gè)處理，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分相同；生根培養(yǎng)基為MS+NAA（0、0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 mg/L）。所有培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30 g/L、瓊脂濃度為7 g/L，pH為5.8-6.0，培養(yǎng)溫度為25-28℃，光照條件為12 h光照/12 h黑暗。

1.2.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析方法 試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理重復(fù)3次，接種后每隔2 d觀察外植體的變化。試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析，平均數(shù)之間差異顯著性比較采用LSD法，柱形圖和折線圖均在Excel2003電子表格下制作。

愈傷誘導(dǎo)率（%）=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

再生頻率（%）=長芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)× 100%

分化頻率（%）=再生不定芽總數(shù)/接種外植體總數(shù)× 100%

生根率（%）=長根的苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 無菌苗苗齡對油菜外植體分化的影響

不同苗齡的油菜外植體（子葉、下胚軸）的再生頻率及分化頻率存在一定差異。在油菜苗齡為5 d時(shí)，子葉、下胚軸的再生頻率及分化頻率均達(dá)到最大，子葉的再生頻率及分化頻率分別為85.26%和100%；下胚軸的再生頻率及分化頻率分別為80.85%和96.75%。

2.2 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對油菜外植體分化的影響

預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對油菜外植體的再生頻率及分化頻率均表現(xiàn)有不同程度的影響。預(yù)培養(yǎng)的子葉和下胚軸的分化效果較好，分化頻率分別為80.20%和83.0%。方差分析結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)5 d后子葉和下胚軸的分化頻率與其他預(yù)培養(yǎng)天數(shù)的相比差異顯著，而再生頻率與其他天數(shù)的相差不大。因此預(yù)培養(yǎng)5 d有利于油菜外植體的分化。

2.3 預(yù)培養(yǎng)基中不同濃度2, 4-D對油菜外植體分化的影響

油菜外植體經(jīng)不同濃度2，4-D處理后的分化情況存在顯著差異。當(dāng)2，4-D濃度為1.0 mg/L-1時(shí)，子葉、下胚軸的再生頻率均達(dá)到最大，分別為87.52%和80.15%；二者的分化頻率也均為最大，分別為120.50%和102.45%。

2.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同濃度6-BA及NAA對油菜外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響

在不同激素組合處理?xiàng)l件下，油菜外植體愈傷組織形成情況差異較大。子葉在6-BA（1.0、2.0、3.0和4.0 mg/L） + NAA（0.05和0.1 mg/L）8個(gè)激素組合處理?xiàng)l件下，愈傷組織形成情況較好，愈傷組織生長較快（圖1-A）；下胚軸在6-BA（1.0、2.0、3.0和4.0 mg/L）+NAA 0.05 mg/L 4個(gè)激素組合處理?xiàng)l件下，愈傷組織形成情況較好，愈傷組織生長較快（圖1-B）。同時(shí)，從圖2中可以看出，在6-BA濃度為1-4 mg/L、NAA濃度為0.05-0.1 mg/L條件下，子葉愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)到100%；下胚軸在6-BA濃度為1-4 mg/L、NAA濃度為0.05 mg/L條件下，愈傷誘導(dǎo)率在90.0%左右。因此，油菜子葉愈傷組織誘導(dǎo)的適宜6-BA濃度為1-4 mg/L，適宜NAA濃度為0.05-0.1 mg/L；下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的適宜6-BA濃度為1-4 mg/L，適宜NAA濃度為0.05 mg/L。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同濃度6-BA及NAA對油菜愈傷組織分化的影響也較大。在本研究所設(shè)的激素條件下，子葉愈傷組織在大多數(shù)激素組合條件下均可分化出不定芽（圖1-C），下胚軸愈傷組織在部分激素組合條件下也可分化出不定芽（圖1-D）。而在有些激素組合條件下，雖可誘導(dǎo)愈傷組織形成，但不能誘導(dǎo)芽的形成。

由圖3可知，在2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA及3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的組合條件下子葉愈傷組織的再生頻率和分化頻率均較高，兩者的再生頻率分別為88.0%和83.33%，兩者的分化頻率分別為104.0%和108.33%。方差分析結(jié)果表明，以上兩個(gè)激素組合條件下子葉愈傷組織的再生頻率及分化頻率差異均不顯著。從圖4可以看出，在4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA的組合條件下下胚軸愈傷組織的再生頻率和分化頻率均為最高，分別為81.82%和104.55%，且與其他組合差異較大。因此，油菜子葉愈傷組織不定芽誘導(dǎo)的最佳激素組合為2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA及3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，油菜下胚軸愈傷組織不定芽誘導(dǎo)的最佳激素組合為4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。

2.5 生根培養(yǎng)基中不同濃度NAA對油菜苗生根的影響

不同濃度NAA條件下油菜苗的生根率及平均得根數(shù)如圖5所示。與不施加NAA的條件相比，施加NAA可以顯著影響油菜苗的生根情況，而且不同NAA濃度下的油菜苗生根情況也存在差異，當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)油菜苗的生根率及平均得根數(shù)均達(dá)到最大值，分別為90.0%和21.6（根）。另外，在0.5 mg/L NAA條件下，油菜苗生根較快，根較粗，根系較發(fā)達(dá)（圖1-D）。因此，油菜苗生根的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA。

3 討論

本研究表明，較高的6-BA濃度及較低的NAA濃度有利于油菜愈傷組織的誘導(dǎo)及分化，這與前人的研究結(jié)果類似［15］。然而通過比較發(fā)現(xiàn)，子葉和下胚軸對不同濃度6-BA及NAA的敏感性存在一定差異，下胚軸比子葉更為敏感。這可能是由于子葉和下胚軸的內(nèi)源激素含量存在差異以及兩者對外源激素的吸收能力不同，具體原因有待進(jìn)一步研究。另外，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入AgNO3是為了促進(jìn)油菜愈傷組織形成不定芽。在愈傷組織形成過程中外植體會產(chǎn)生大量乙烯，而乙烯對芽的形成有一定的抑制作用，Ag+可與乙烯競爭作用部位，減弱乙烯的抑制作用，從而間接地促進(jìn)油菜愈傷組織形成不定芽，提高油菜再生頻率及分化頻率［16，17］。已有研究表明［7，8，18］，促進(jìn)油菜愈傷組織形成不定芽的適宜AgNO3濃度為5 mg/L。由于品種差異，本試驗(yàn)的AgNO3濃度選擇為3.5 mg/L。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對甘藍(lán)型油菜HC8的離體再生研究，成功建立了油菜HC8的高效離體再生體系。其組織培養(yǎng)最佳苗齡為5 d；最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為5 d，最適2，4-D濃度為1.0 mg/L；子葉最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3或MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3；下胚軸最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3；最佳生根培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA。

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