肖軍 楊濤 楊鎮(zhèn) 王紅 王麗萍 陳珣 肇瑩 王娜 龔娜

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心，沈陽 110161）

內(nèi)生菌醇提取物RD為遼寧省農(nóng)科院微生物工程中心經(jīng)過多年潛心研究開發(fā)出來的新一代植物生長調(diào)節(jié)劑，來源于人參和越橘內(nèi)生菌的醇提取物。施用微量即可有效促進(jìn)水稻的營養(yǎng)生長，提高水稻對(duì)氮肥的利用效率［1］，增強(qiáng)水稻的抗病性。內(nèi)生菌醇提取物RD對(duì)水稻的作用機(jī)制復(fù)雜，機(jī)理仍不明確，已成為制約其應(yīng)用的障礙。為了全面認(rèn)清內(nèi)生菌醇提取物RD對(duì)水稻的作用機(jī)制，僅僅對(duì)單個(gè)基因的功能進(jìn)行研究顯然是不夠的，還需要從整個(gè)基因組水平上了解水稻的基因表達(dá)在內(nèi)生菌醇提取物RD處理后是如何變化的，哪些基因在此過程中真正起作用。要從整個(gè)基因組水平上研究內(nèi)生菌醇提取物RD的作用機(jī)制，成為當(dāng)前破解內(nèi)生菌醇提取物RD促進(jìn)水稻生長、增強(qiáng)抗病性機(jī)理的關(guān)鍵。

基因芯片技術(shù)是近年來發(fā)展起來的基因組整體研究技術(shù)，它是功能基因組學(xué)研究的重要技術(shù)之一［2，3］，被廣泛應(yīng)用于分析特定生物過程中基因表達(dá)的全面信息［4-6］。該技術(shù)可以同時(shí)分析成千上萬個(gè)基因，所得的數(shù)據(jù)可直接用于基因功能的研究。這樣就可在轉(zhuǎn)錄水平上靈敏、完整地給出細(xì)胞或組織樣本的一系列生理狀態(tài)的分析結(jié)果，尋找和鑒定特異性相關(guān)基因，是從分子水平上揭示植物生理機(jī)制的一項(xiàng)基礎(chǔ)性研究。

本研究旨在利用基因芯片手段，檢測(cè)內(nèi)生菌醇提取物RD處理水稻根部后基因差異表達(dá)，探討內(nèi)生菌醇提取物RD能夠促進(jìn)水稻生長、增強(qiáng)水稻抗病性的作用機(jī)制，為這種純天然、綠色的植物生長調(diào)節(jié)劑廣泛應(yīng)用于水稻提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 水稻品種遼星一號(hào)，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院稻作所提供。

1.1.2 內(nèi)生菌醇提取物 內(nèi)生菌醇提取物RD由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心提供。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 水稻遼星一號(hào)種子用0.1% HgCl消毒10 min，無菌水沖洗3遍，25℃浸種至水稻露白，沙培培養(yǎng)7 d。將培養(yǎng)7 d的水稻根部浸于濃度為50 ng/mL RD水溶液中，24 h后取出，以無菌水處理為對(duì)照，水中再培養(yǎng)24 h。取水稻幼嫩的根部立即投入液氮速凍，然后置-70℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 總RNA提取 根據(jù)Trizol（寶生物公司）說明書分別提取內(nèi)生菌醇提取物RD處理和對(duì)照的水稻根系總RNA，用0.8%甲醛變性瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)總RNA中28S rRNA和18S rRNA比例，以檢測(cè)RNA樣品的質(zhì)量。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的含量和濃度。

1.2.3 對(duì)樣品RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記 采用博奧公司晶芯cDNA擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒，對(duì)樣品RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記。本研究使用Cy3、Cy5 進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記，其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為550 nm/570 nm和649 nm/670 nm。通過探針樣本與芯片上飽和cDNA之間的競(jìng)爭(zhēng)性雜交，將樣本之間的雜交信號(hào)對(duì)比，即基因間的差異表達(dá)用數(shù)值表示出來。芯片由北京博奧生物芯片公司制備。對(duì)提取的總RNA，采用RNeasy MinElute Cleanup Kit（Qiagen公司）純化總RNA，利用One-cycle cDNA Synthesis Kit（Affymetrix公司）合成dscDNA，并用GeneChip Sample Cleanup Module（Affymetrix公司）純化該cDNA。按照GeneChip IVT Labeling Kit說明書制備生物素標(biāo)記的cRNA，于94℃保溫35 min后進(jìn)行片段化處理，并作為雜交探針用于基因芯片分析。

1.2.4 基因芯片雜交 用于雜交的基因芯片為Affymetrix公司的Rice Genome Array，產(chǎn)品編號(hào)：AFF-900599，芯片覆蓋約51 279個(gè)轉(zhuǎn)錄本，代表兩種水稻品系，大約48 564個(gè)Japonica品系轉(zhuǎn)錄本和1 260個(gè)Indica品系轉(zhuǎn)錄本。序列信息來源于GenBank mRNAs，TIGR基因預(yù)測(cè)和國際水稻基因組序列計(jì)劃。NCBI UniGene Build #52（May 7，2004），GenBank預(yù)測(cè)基因，TIGR Os1 v2 data set.（ftp.tigr.org FASTA，89.3 MB）。

內(nèi)生菌醇提取物RD處理和對(duì)照的水稻根部總RNA與芯片雜交，取適量cRNA與試驗(yàn)芯片（experimentalchip）在45℃的Affymetrix雜交箱640中，60 r/min旋轉(zhuǎn)雜交16 h。在Affymetrix公司Genechip fluidics station洗滌工作站450中進(jìn)行洗脫和染色。用Affymetrix公司GeneChip Scanner3000高分辨率掃描儀對(duì)染色后的芯片進(jìn)行掃描，利用Affymetrix GeneChip Operating Software Version1.4軟件對(duì)芯片掃描所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和處理。

1.2.5 基因芯片的數(shù)據(jù)處理 采用Robust Multichip Analysis（RMA）歸一化方法，檢測(cè)水稻樣品中每個(gè)基因（probe set）的信號(hào)值；用P、A、M表示Probe Set的檢測(cè)狀態(tài)：P（Present）存在、A（Absent）不存在、M（Marginal）臨界值。并刪除了熒光信號(hào)弱的基因以及芯片上的陰性對(duì)照、內(nèi)標(biāo)、外標(biāo)等冗余數(shù)據(jù)。在比較分析兩組雜交結(jié)果時(shí)，取內(nèi)生菌醇提取物RD處理水稻樣本和對(duì)照樣本同一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)水平（信號(hào)值）進(jìn)行比值計(jì)算，以上調(diào)或下調(diào)2倍標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因，即Ratio≥2.0和≤0.5。再用晶芯生物分子功能注釋系統(tǒng)（Capital-Bio Molecule Annotation System，MAS）對(duì)篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，并注釋差異表達(dá)顯著的基因功能。

2 結(jié)果

2.1 水稻總RNA質(zhì)量檢測(cè)

在基因芯片雜交中，RNA的質(zhì)量直接影響標(biāo)記效率和試驗(yàn)的成功率。本研究選取水稻培養(yǎng)7 d的幼嫩根尖，用Trizol法提取其總RNA。用0.8%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1）顯示，RNA完整性較好，電泳條帶清晰，28S rRNA比18S rRNA條帶亮度大于11，A260/A280的吸光度比值均在1.86-1.93之間（表1），RNA的質(zhì)量符合后續(xù)芯片試驗(yàn)要求。

表1 內(nèi)生菌醇提取物RD處理水稻和對(duì)照總RNA

2.2 芯片雜交結(jié)果統(tǒng)計(jì)

提取內(nèi)生菌醇提取物RD處理水稻和對(duì)照試驗(yàn)的熒光數(shù)據(jù)，校正后將兩張熒光交換的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合做散點(diǎn)圖，通過散點(diǎn)圖可以比較直觀地看出在兩個(gè)樣品之間基因表達(dá)的差異情況。其中X 軸和Y 軸分別以兩個(gè)樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度值為坐標(biāo)，圖2中每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表芯片上一個(gè)基因點(diǎn)的雜交信號(hào)，上調(diào)基因、下調(diào)基因及表達(dá)基本無差異的基因如圖中所示。以芯片熒光信號(hào)對(duì)數(shù)值（signal log2ratio）>2以及<0.5為閾值，篩選表達(dá)量變化在2倍以上基因，由圖2可以看出試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)點(diǎn)大多數(shù)集中在0.52和<0.5的差異表達(dá)基因1 171個(gè)，其中上調(diào)671個(gè)，下調(diào)基因500個(gè)。并且上調(diào)基因中Ratio>3.0的有218個(gè)，Ratio>4.0的有115個(gè)，下調(diào)基因中差異表達(dá)顯著的基因Ratio<0.4有226個(gè)，Ratio<0.3的基因有72個(gè)。

2.3 差異表達(dá)基因的功能注釋

根據(jù)基因芯片的試驗(yàn)結(jié)果，采用晶芯生物分子功能注釋系統(tǒng)V3.0（MAS）和數(shù)據(jù)庫查詢，對(duì)內(nèi)生菌醇提取物RD處理獲得的1 171個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋（圖3）。其中43.36%基因參與各種生物學(xué)過程（biological process）；20.35%基因與生成各種細(xì)胞組分（celluar component）有關(guān)；34.51%基因編碼產(chǎn)物則與執(zhí)行各種分子功能（molecular function）有關(guān)。1.78%與GenBank中功能未知序列（others）相對(duì)應(yīng)，這些基因在內(nèi)生菌醇提取物RD對(duì)水稻的促進(jìn)生長中所起的作用還需進(jìn)一步研究。差異表達(dá)基因的分子功能又歸納為22個(gè)功能類群（圖4），主要為生理功能、結(jié)合功能、刺激應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生殖過程、代謝功能。說明內(nèi)生菌醇提取物RD處理影響基因的表達(dá)不是某個(gè)基因孤立、單一的，而是多方面、多層次共同作用的結(jié)果。表2中列舉了基因表達(dá)量變化較大的重要基因及其功能描述。

2.4 代謝途徑的變化情況

采用晶芯生物分子功能注釋系統(tǒng)V3.0（MAS）中pathway注釋系統(tǒng)，利用kegg數(shù)據(jù)庫查詢，對(duì)內(nèi)生菌醇提取物RD處理后引起水稻代謝途徑的改變進(jìn)行分析。內(nèi)生菌醇提取物RD處理后代謝途徑的變化存在明顯差異，表達(dá)量上調(diào)的代謝途徑數(shù)量多于下調(diào)的數(shù)量。圖5進(jìn)行了表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的代謝途徑比較，期中表達(dá)量上調(diào)代謝途徑39條，表達(dá)量下調(diào)代謝途徑24條。

3 討論

代謝是作物最基本的生命活動(dòng)過程。內(nèi)生菌醇提取物RD處理水稻后涉及的代謝途徑非常復(fù)雜。圖5表明，其中表達(dá)量上調(diào)最為明顯的代謝途徑有谷氨酸代謝、氮代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、精氨酸、脯氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、酪氨酸代謝等，光合作用是作物生產(chǎn)最基本

的生理過程之一，也是重要的生物合成過程，植物干物質(zhì)90%以上是通過光合作用合成的，因此是栽培作物產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，也是碳代謝的一個(gè)重要部分。氮代謝為碳代謝提供酶和光合色素，影響著作物光合同化潛力。谷氨酸代謝、脯氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、酪氨酸代謝等為參與保護(hù)、防御和脅迫耐受相關(guān)的代謝途徑。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成對(duì)植物蛋白質(zhì)、信息素、抗氧化劑和木質(zhì)素等生物質(zhì)的合成非常重要。

表2 部分差異表達(dá)基因

基因表達(dá)分析的基礎(chǔ)是基因在生命活動(dòng)過程中有許多變化，由于基因表達(dá)與功能特異性一致，因而能夠根據(jù)基因功能在某個(gè)特定生理階段的上調(diào)和下調(diào)變化來推導(dǎo)基因功能［7］。圖4表明，具有催化活性、代謝功能、細(xì)胞過程、生理過程、細(xì)胞器分子功能的上調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)量遠(yuǎn)高于下調(diào)差異表達(dá)基因。表2中列舉了基因表達(dá)顯著上調(diào)和下降Ratio>5和Ratio<0.25的部分基因，期中上調(diào)最大的基因Ratio=29.09，水稻鐵載體基因OslRT1［8］，是ZIP基因家族的一種［9］，F(xiàn)e（Ⅱ）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為一種質(zhì)膜蛋白，在將膜外的Fe（Ⅱ）轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)中起關(guān)鍵作用，它與Fe（Ⅲ）-螯合物還原酶共同完成植物對(duì)鐵素的吸收［10，11］。草酸氧化酶（oxalate oxidase）又稱萌發(fā)類似蛋白（germin-like protein），馮潔等［12］研究推斷水稻中草酸氧化酶抗病反應(yīng)中的作用可能與麥類作物中的草酸氧化酶相似。細(xì)胞色素P450是一類以還原態(tài)與CO結(jié)合后在波長450 nm處有吸收峰的含血紅色素的多功能氧化酶［13］。目前，已從111種植物中獲得1 052個(gè)植物細(xì)胞色素P450基因，部分P450基因功能已得到鑒定［14］。P450在植物體中具有生物合成和代謝解毒兩大功能，其中一些能催化結(jié)構(gòu)抗病物質(zhì)（如木質(zhì)素、角質(zhì)層和樹脂）、植保素（如異黃酮和甜椒素）、毒素（即殺蟲劑，如生氰糖苷和丁布）、脅迫信號(hào)物質(zhì)（茉莉酸、創(chuàng)傷激素和Divinyl ethers）的合成，從而在植物防御反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用［15］。硝酸還原酶（Nitrate reductase）是植物NO3-同化的關(guān)鍵酶，植物體內(nèi)硝酸還原酶活力（NRA）的高低直接影響介質(zhì)中NO3-的利用，被作為作物的營養(yǎng)指標(biāo)之一［16］。許多研究已經(jīng)表明，幾丁質(zhì)酶（Chitinase）在植物體內(nèi)的誘導(dǎo)與積累，對(duì)于增強(qiáng)植物防衛(wèi)能力發(fā)揮著重要作用［17］。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)來源于野生植物內(nèi)生菌的醇提取物RD對(duì)水稻基因表達(dá)差異影響，獲得了差異表達(dá)基因1 171個(gè)，期中上調(diào)基因671個(gè)，下調(diào)基因500個(gè)。其中43.36%基因參與各種生物學(xué)過程；20.35%基因與生成各種細(xì)胞組分有關(guān)；34.51%基因編碼產(chǎn)物則與執(zhí)行各種分子功能有關(guān)。這些差異表達(dá)基因參與了多個(gè)生物學(xué)過程，包括各種生理過程、生殖過程、刺激應(yīng)答、代謝功能、生物調(diào)節(jié)等。采用GO注釋系統(tǒng)上調(diào)表達(dá)基因分為20種生物功能，影響39條代謝通路，下調(diào)表達(dá)基因分為21種生物功能，影響24條代謝通路。

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