張丹鳳 陳國(guó)平 華秀庭 陳陽(yáng)

（1.漳州師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，漳州 363000；2.漳州市農(nóng)業(yè)局種植業(yè)管理站，漳州 363000）

革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁有兩層膜——外膜和內(nèi)膜，外膜上有許多的外膜蛋白，其中包括外膜A蛋白、孔蛋白和脂蛋白等［1］。外膜蛋白處于最外層外膜上，它參與了多項(xiàng)生理功能，包括具有讓外界物質(zhì)進(jìn)入的通道功能、幫助細(xì)菌攝取鐵離子、參與革蘭氏陰性細(xì)菌感染的粘附和炎癥、激發(fā)宿主產(chǎn)生免疫保護(hù)性等生理功能，對(duì)于細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境和形成致病能力至關(guān)重要［2］。

NmpC蛋白質(zhì)是一種外膜孔蛋白，組成磷脂雙分子層中的微孔通道，可選擇性地促進(jìn)親水分子通過(guò)革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜［3］。大腸桿菌 K-12△ompF和△ompC突變株中NmpC的表達(dá)量增加［4］；進(jìn)一步研究表明，大腸桿菌中NmpC蛋白質(zhì)可以取代OmpF或者OmpC的功能，NmpC的表達(dá)會(huì)降低OmpF和OmpC孔蛋白的表達(dá)量［5］。同時(shí)大腸桿菌NmpC和鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）中NmpC類(lèi)似蛋白OmpD與OmpN蛋白功能極其相似［6］。NmpC還是一種新發(fā)現(xiàn)的與大腸桿菌耐藥、耐熱相關(guān)的外膜蛋白質(zhì)［7，8］。除此之外，NmpC蛋白的表達(dá)受到TolC蛋白表達(dá)和nmpC啟動(dòng)子DNA成環(huán)的調(diào)控［9，10］。從蛋白質(zhì)水平可以更充分地研究蛋白質(zhì)的功能，但是目前還未見(jiàn)從基因刪除的角度來(lái)進(jìn)一步探討NmpC蛋白質(zhì)的功能。因此，基于Red重組系統(tǒng)和Xer重組系統(tǒng)構(gòu)建了無(wú)標(biāo)記的ΔnmpC基因刪除菌株，旨在為深入探討NmpC的功能及其分子機(jī)制奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌 K-12 BW25113為本實(shí)室保存菌種；質(zhì)粒pKD46（溫度敏感型，含有阿拉伯糖啟動(dòng)子調(diào)控的gam、bet和exo基因，Ampr）和pSK-difGm（含有兩邊帶有dif 位點(diǎn)［11］的慶大霉素抗性基因、Ampr和Gmr）均購(gòu)于江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司。質(zhì)粒pMD18-T simple vector 購(gòu)于TaKaRa寶生物（大連）公司。

1.1.2 試劑和引物 Taq和Pfu DNA聚合酶、連接酶solution I、EcoR I和Hind III限制性?xún)?nèi)切酶、質(zhì)粒提取、純化試劑盒和膠回收試劑盒為均為 TaKaRa寶生物（大連）公司產(chǎn)品?？股貞c大霉素和氨芐青霉素購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司。大腸桿菌基因刪除試劑盒購(gòu)于江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司。本研究所用引物序列如表1所示。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增nmpC片段 提取大腸桿菌 K-12 BW25113基因組，利用引物nmpC1和nmpC2進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR體 系 為：基 因 組DNA 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、2.5 mmol/L Mg2+2 μL、25 mmol/L nmpC1和nmpC2各0.3 μL、Taq DNA聚合酶0.4 μL、10×緩沖液 5 μL和ddH2O 36 μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 75 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳和膠回收。

1.2.2 nmpC基因刪除用線(xiàn)性化DNA片段的制備 將膠回收的nmpC片段，通過(guò)連接酶solution I與pMD18-T simple vector進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，經(jīng)Hind III單酶切驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒pMD-nmpC。該重組質(zhì)粒用EcoR I酶切，切除nmpC片段中150 bp片段，經(jīng)電泳膠回收目的片段pMD-nmpC1。進(jìn)一步通過(guò)Pfu DNA聚合酶補(bǔ)平pMD-nmpC1酶切切口，乙醇沉淀回收目的片段。補(bǔ)平后的目的片段用堿性磷酸酶CIAP進(jìn)行去磷酸化得到pMD-nmpC2，防止平末端發(fā)生自身連接。Sma I酶切pSK-difGm，獲得difGm片段。difGm片段與pMD-nmpC2連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒T-nmpC∷difGm。經(jīng)Hind III單酶切驗(yàn)證，獲得含有突變盒的重組質(zhì)粒T-nmpC∷difGm。

1.2.3 突變盒片段的PCR 擴(kuò)增 將含有突變盒片段的重組質(zhì)粒T-nmpC∷difGm用Hind III酶切線(xiàn)性化，電泳回收線(xiàn)性的重組質(zhì)粒片段，去除環(huán)形質(zhì)粒。以該片段為模板，利用引物nmpC1和nmpC2 PCR擴(kuò)增獲得突變盒nmpC∷difGm，膠回收PCR 產(chǎn)物獲得高濃度突變盒片段。

1.2.4 電轉(zhuǎn)化突變盒片段入大腸桿菌細(xì)胞 通過(guò)CaCl2轉(zhuǎn)化法將pKD46轉(zhuǎn)化大腸桿菌 K-12 BW25113。將含有pKD46的大腸桿菌 K-12 BW25113接種于LB平板，30℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基，30℃條件下200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。取0.5 mL 培養(yǎng)液接種于50 mL含有氨芐青霉素（100 μg/mL）和2 mmol/L L-阿拉伯糖的新鮮LB 液體培養(yǎng)基，30℃、200 r/min培養(yǎng)至A600值約為0.7。將培養(yǎng)液迅速置于冰上冷卻20 min，4℃、4 000 r/min離心10 min 收集菌體。傾倒培養(yǎng)基，并輕柔地將菌體重新懸浮于20 mL預(yù)冷的10%（V/V）甘油溶液中，離心收集菌體，并將菌體重懸于20 mL預(yù)冷的10%（V/V）甘油溶液中，并重復(fù)該步驟2次，將上清液傾倒，并將菌體用殘留的約100 μL 10%（V/V）甘油溶液重懸。輕柔地將50 μL菌體溶液與35 μL純化后的突變盒PCR 產(chǎn)物混合，置于0.1 cm預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)儀1.8 kV進(jìn)行電擊，電擊時(shí)間為4-5 ms。迅速加入1 mL 含有1 mmol/L L-阿拉伯糖的LB 液體培養(yǎng)基，將菌液在37℃培養(yǎng)1 h后，涂布于含有慶大霉素（30 g/mL）的LB 固體培養(yǎng)基上篩選重組菌株。

1.2.5 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證 挑取慶大霉素抗性篩選獲得的轉(zhuǎn)化子，利用引物Gm1和nmpC3進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證大腸桿菌 K-12 BW25113和重組菌株，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.2.6 Xer重組酶系介導(dǎo)的慶大霉素抗性基因的去除 將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于LB 液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，然后轉(zhuǎn)接于新鮮LB液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h。稀釋培養(yǎng)液至適當(dāng)濃度，涂布LB平板，37℃培養(yǎng)。挑取單菌落同時(shí)點(diǎn)種于含慶大霉素的固體LB平板和不含慶大霉素的普通固體LB平板，挑選慶大霉素抗性丟失的轉(zhuǎn)化子（在dif 位點(diǎn)進(jìn)行了Xer 重組的細(xì)胞失去了慶大霉素抗性），并用nmpC1和nmpC2引物進(jìn)行進(jìn)一步的菌落 PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證，最終獲得沒(méi)有抗生素標(biāo)記的基因刪除菌株。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

經(jīng)Vector NTI軟件分析nmpC基因內(nèi)部有2個(gè)EcoR I位點(diǎn)，2個(gè)位點(diǎn)中間有150 bp的堿基序列，通過(guò)酶切去除這150 bp堿基，并經(jīng)Pfu補(bǔ)平后與經(jīng)Sma I酶切獲得的difGm片段進(jìn)行連接。在2個(gè)EcoR I位點(diǎn)外圍各擴(kuò)增500 bp堿基作為同源臂用于整合，在Red 重組酶的作用下進(jìn)行雙交換，將目的基因替換，進(jìn)一步在自身Xer重組酶的介導(dǎo)下，進(jìn)行2個(gè)dif位點(diǎn)的重組將抗生素標(biāo)記基因去除。

2.2 重組質(zhì)粒pMD-nmpC的構(gòu)建

利用引物nmpC1和nmpC2對(duì)nmpC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期1 016 bp的片段大小相當(dāng)?shù)哪康钠危Y(jié)果如圖1-A所示。將該目的片段與pMD18-T simple vector進(jìn)行連接，獲得pMD-nmpC重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒圖譜如圖2-A所示。提取pMDnmpC重組質(zhì)粒，經(jīng)Hind III酶切，圖1-B第2泳道顯示酶切片段大小約為3 703 bp，成功獲得了含有nmpC基因片段的重組質(zhì)粒。

2.3 重組質(zhì)粒T-nmpC∷difGm的構(gòu)建

大量提取pMD-nmpC，利用EcoR I酶切去除nmpC基因中150 bp的片段，得到約3.6 kb的pMD18-nmpC1片段（圖1-B第3泳道）。Sma I酶切pSK-difGm，獲得difGm片段，difGm片段與去磷酸化的、補(bǔ)平酶切切口的pMD18-nmpC2連接，獲得重組質(zhì)粒T-nmpC∷difGm，其物理圖譜如圖2-C所示。用Hind III對(duì)T-nmpC∷difGm進(jìn)行單酶切，如圖3-A所示獲得大小為4 585 bp的目的條帶，與預(yù)期大小一致。

圖1 nmpC基因PCR擴(kuò)增片段（A）及pMD-nmpC重組質(zhì)粒（B）

2.4 nmpC∷difGm的PCR 擴(kuò)增

用Hind III對(duì)T-nmpC∷difGm重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，進(jìn)行膠回收，獲得線(xiàn)性化的T-nmpC∷difGm。以此目的片段為模板，通過(guò)引物nmpC1和nmpC2進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得突變盒nmpC∷difGm，獲得大小約1 900 bp的目的條帶，與預(yù)計(jì)的片段大小相當(dāng)（圖3-B）。

2.5 ΔnmpC基因刪除菌株的鑒定

膠回收突變盒nmpC∷difGm，獲得高濃度的純化的突變盒，將其電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 K-12 BW25113細(xì)胞中。慶大霉素抗性篩選獲得的轉(zhuǎn)化子，通過(guò)引物Gm1和nmpC3經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證確認(rèn)，獲得片段大小約1.2 kb的目的片段（圖4第1泳道）。依次傳代去除慶大霉素抗性和pKD46，獲得不具有慶大霉素抗性的目標(biāo)菌株。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證（引物nmpC1和nmpC2）只獲得大小約850 bp的片段（圖4第5泳道）。結(jié)果顯示，成功獲得了ΔnmpC基因突變無(wú)標(biāo)記菌株。

3 討論

圖2 重組質(zhì)粒物理圖譜

圖3 T-nmpC∷difGm酶切（A）及nmpC∷difGm PCR擴(kuò)增（B）產(chǎn)物

圖4 nmpC基因刪除轉(zhuǎn)化子PCR鑒定電泳圖譜

基因刪除技術(shù)是一種從分子水平上定向改變生物活體遺傳信息的試驗(yàn)手段，對(duì)于研究基因和蛋白功能等生命科學(xué)的重大問(wèn)題十分重要?；讦耸删wRed重組酶作用的同源重組技術(shù)逐漸成為基因工程研究的熱點(diǎn)之一，BaBa等［12］利用這種方法，已經(jīng)對(duì)大腸桿菌 K-12中3 985個(gè)目的基因進(jìn)行刪除，并由此建立起新的大腸桿菌基因庫(kù)（http：//ecoli.aist-nara.ac.jp/）。但是該方法在去除抗生素標(biāo)志時(shí)，需要進(jìn)行帶有相應(yīng)重組酶基因的外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，使試驗(yàn)周期延長(zhǎng)。Bloor 等［11］采用Red重組系統(tǒng)-Xer重組系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)靶基因重組后抗生素標(biāo)記高效刪除，方法簡(jiǎn)便。目前該技術(shù)已經(jīng)在多種微生物細(xì)胞成功獲得無(wú)抗生素標(biāo)記的基因刪除菌株，包括大腸桿菌、幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori）、分枝桿菌（Mycobacteria）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等［13，14］。本研究運(yùn)用該技術(shù)利用大腸桿菌細(xì)胞中自身Red重組系統(tǒng)-Xer重組系統(tǒng)，通過(guò)PCR驗(yàn)證獲得無(wú)抗生素標(biāo)記的基因刪除菌株ΔnmpC。NmpC的表達(dá)量與OmpF和OmpC的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［4，5］，期望利用該基因刪除菌株來(lái)深入探討NmpC的缺失表達(dá)對(duì)OmpF和OmpC表達(dá)的影響，甚至與調(diào)控OmpF和OmpC表達(dá)的EnvZ/OmpR雙調(diào)節(jié)系統(tǒng)之間的關(guān)系。NmpC是新發(fā)現(xiàn)的與大腸桿菌適應(yīng)逆境的外膜蛋白［7，8］，通過(guò)ΔnmpC可以進(jìn)一步驗(yàn)證它在大腸桿菌耐受不利環(huán)境過(guò)程中的作用，及與其它相關(guān)功能蛋白間錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，均將促進(jìn)NmpC外膜蛋白功能的闡明。

4 結(jié)論

首次成功地在大腸桿菌Red 重組系統(tǒng)和Xer重組系統(tǒng)的介導(dǎo)下，獲得大腸桿菌ΔnmpC無(wú)抗生素標(biāo)記基因刪除菌株，該基因刪除菌株將有利于進(jìn)一步探討NmpC在大腸桿菌不同生理過(guò)程的作用及其它功能。

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