柴文瓊 王繼卿 胡江 劉秀 李少斌 羅玉柱

（甘肅農(nóng)業(yè)大學甘肅省草食動物生物技術重點實驗室 動物科學技術學院 研究測試中心，蘭州 730070）

主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）是由緊密連鎖的高度多態(tài)性基因座所組成的染色體上的一個與免疫應答和抗病性密切相關的多基因復合體。它廣泛存在于脊椎動物中，決定著動物的免疫排斥反應［1］。MHC基因復合體由Ⅰ、Ⅱ類和Ⅲ類3類基因組成。Ⅱ類基因包括高度多態(tài)的DQ和DR基因家族，DQ 基因家族至少含有DQA1、DQA2、DQB1和DQB2等4個基因座位。它們所編碼的MHC抗原在其免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著最重要的作用，與家畜的多種疾病之間存在強相關。如牛乳房炎、口蹄疫、慢性后脊椎輕癱，綿羊的線蟲、癢病、包蟲病，雞傳染性疾病等［2-6］。山羊的MHC 稱為GoLA（Goat lymphocyte antigen），即山羊白細胞抗原。山羊GoLA的結(jié)構和功能與牛、綿羊非常相似，具有高度多態(tài)性和連鎖不平衡的特點。國內(nèi)外對山羊GoLA遺傳多態(tài)性的研究主要集中在GoLADRB1和GoLA-DRB3［7-9］基因上，但是尚未見我國優(yōu)良地方山羊品種DQA基因的研究報道，明顯不利于我國地方山羊品種的合理利用和抗病育種研究。

河西絨山羊是中國固有的三大絨山羊品種之一，現(xiàn)存欄116.8萬只（占甘肅省山羊存欄總量的30.22%），是甘肅省絨山羊生產(chǎn)的重要遺傳資源。但流產(chǎn)嚴重影響著河西絨山羊的健康發(fā)展。據(jù)課題組對26 831只河西絨山羊適繁母羊的調(diào)查，河西絨山羊平均流產(chǎn)率達20%以上。其他學者也證實了河西絨山羊流產(chǎn)病的發(fā)生［10］。目前還沒有針對山羊流產(chǎn)的專用治療藥物，因此只能通過藥物預防和加強飼養(yǎng)管理來降低流產(chǎn)率，但使用藥物會造成畜產(chǎn)品品質(zhì)下降（如羊肉），且和加強飼養(yǎng)管理一樣，雖然在預防流產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用，但無法根除它。相同環(huán)境條件下個體對山羊流產(chǎn)病的抗性有差異，為從遺傳本質(zhì)上消滅此病提供了理論依據(jù)，但前提是需要找到與流產(chǎn)相關的抗性等位基因。因此，本研究應用PCR-SSCP和測序技術，以與家畜多種疾病存在強相關的GOLA-DQA1基因為研究對象，分析河西絨山羊DQA1基因第2外顯子的遺傳特征，探討等位基因頻率與山羊流產(chǎn)的相關性，以期為河西絨山羊抗流產(chǎn)病分子育種提供基礎性資料。

1 材料與方法

1.1 材料

采集864只河西絨山羊血樣記錄是否流產(chǎn)，其中正常個體610只，流產(chǎn)254只。頸靜脈采血10 mL，ACD抗凝，-20℃保存。采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取血液基因組DNA［11］。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及PCR擴增 參照GenBank中山羊DQA1基因第2外顯子序列（AY464657）設計1對引物，由大連寶生物有限公司合成。引物序列見表1。

PCR反應體系：總體積20 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.3 μL，10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）2 μL，10 pmol/μL引物0.4 μL，模板1 μL，加H2O補足20 μL。PCR反應條件：94℃預變性2 min；94℃ 30 s，60℃ 35 s，72℃ 30 s，共32個循環(huán)；72℃ 7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠（含EB）檢測，用凝膠成像儀檢驗擴增效果。

表1 DQA1基因第2外顯子的引物序列、擴增長度及退火溫度

1.2.2 SSCP分析及序列測定 取PCR產(chǎn)物2-3 μL，與8 μL加 樣 緩 沖 液（98% formamide，10 mmol/L EDTA，0.025% bro-mophenol blue，0.025% xylenecyanol）混合，98℃變性10 min，立即轉(zhuǎn)置冰上冷卻，加入14%（37.5∶1）的非變性聚丙烯酰胺凝膠，在0.5×TBE、4℃、280 V電壓下，電泳18 h。為保證內(nèi)循環(huán)溫度不受外界溫度影響，電泳在溫控室進行。電泳結(jié)束后，采用銀染法顯色，判定等位基因和基因型。

1.2.3 測序 純合子PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司直接進行序列測定，雜合子克隆后對菌液進行序列測定。為確保結(jié)果準確，所有等位基因序列均選擇2個以上的不同個體測序2次。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)文獻［12，13］統(tǒng)計基因型，計算χ2值、多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）和位點的雜合度（He）。使用SPSS16.0軟件比較河西絨山羊不同等位基因與山羊流產(chǎn)的關聯(lián)性。

2 結(jié)果

2.1 DQA1基因第2外顯子PCR-SSCP檢測結(jié)果與序列分析

PCR-SSCP檢測結(jié)果（圖1）顯示，河西絨山羊DQA1第2外顯子共存在A、B、C、D、E、F、G、H、I 9個等位基因。與GenBank中山羊GOLA-DQA1基因第2外顯子序列比對發(fā)現(xiàn)，GOLA-DQA1*B、GOLADQA1*E和GOLA-DQA1*H 3個等位基因為本研究新發(fā)現(xiàn)，Cahi-DQA1.7［14］未在本研究中發(fā)現(xiàn)。根據(jù)等位基因核苷酸序列比對結(jié)果（圖2）顯示，河西絨山羊DQA1中發(fā)現(xiàn)42個核苷酸多態(tài)位點，占總分析位點的12.65%（42/332）。其中轉(zhuǎn)換位點23個，占核苷酸多態(tài)位點的54.76%（23/42），包括G/A的轉(zhuǎn)換位點15個，T/C的轉(zhuǎn)換位點8個；顛換位點13個，占核苷酸多態(tài)位點的30.95%（13/42）；轉(zhuǎn)換和顛換共存位點5個，占11.9%（5/42）；本試驗還發(fā)現(xiàn)1個插入位點（17位點）。因此，河西絨山羊DQA1基因第2外顯子多態(tài)性較豐富，轉(zhuǎn)換在核苷酸多態(tài)位點中占優(yōu)勢（54.76%）。

圖1 河西絨山羊GOLA-DQA1基因第2外顯子PCR-SSCP檢測結(jié)果

2.2 DQA1基因第2外顯子遺傳特征分析

河西絨山羊DQA1等位基因頻率（表2）表明，在9等位基因中GOLA-DQA1*G的頻率最高（21.82%），其次是GOLA-DQA1*D和GOLA-DQA1*C，等位基因頻率分別為18.75%和15.16%。等位基因GOLA-DQA1*B和GOLA-DQA1*I的頻率最低，僅分別為4.22%和2.60%。

多態(tài)性分析結(jié)果（表3）表明，河西絨山羊多態(tài)信息含量為0.837 9，屬于高度多態(tài)，雜合度和有效等位基因數(shù)分別為0.421 3和6.879 5，說明河西絨山羊有豐富的遺傳多樣性。經(jīng)χ2適合性檢驗，河西絨山羊各基因座位的基因頻率分布明顯偏離Hardy-Weinborg平衡（P<0.01）。

表2 河西絨山羊DQA1基因第2外等位基因頻率

2.3 DQA1基因第2外顯子多態(tài)性與山羊流產(chǎn)關聯(lián)性分析

經(jīng)SPSS單變量線性模型分析（表4）［15］，病例組與正常組之間的等位基因分布差異顯著（P<0.05），病例組中等位基因GOLA-DQA1*A的頻率顯著高于正常組（P<0.05），等位基因GOLA-DQA1*H的頻率顯著低于正常組（P<0.05）。其余各等位基因頻率無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

表3 DQA1基因第2外顯子群體遺傳結(jié)構

表4 河西絨山羊正常組與病例組等位基因頻率

多態(tài)性且多堿基突變是脊椎動物MHC的一個突出特點。與人類、小鼠、牛、豬、綿羊和家禽等相比，山羊MHC遺傳多態(tài)性的研究主要集中在DRB1和DRB3兩個等位基因［7-9，16］上，結(jié)果表明山羊DRB1、DRB3基因多態(tài)性極為豐富。有關GoLA-DQA1基因的研究很少，只有Amills等［17］利用PCR-SSCP 方法檢測到7個等位基因，發(fā)現(xiàn)了23個氨基酸多態(tài)位點。Zhou 等［18］在GoLA-DQA2中發(fā)現(xiàn)了11個等位基因。本研究應用PCR-SSCP技術，在河西絨山羊GoLA-DQA1基因中檢測到9個等位基因。與GenBank中已有序列相比，本研究在DQA1中新發(fā)現(xiàn)了GoLA-DQA1*B、GoLA-DQA1*E和GoLADQA1*H3個等位基因，未發(fā)現(xiàn)Cahi-DQA1.7。本研究結(jié)果使DQA1等位基因數(shù)目從7個增加到9個。同時在DQA1中發(fā)現(xiàn)42個核苷酸多態(tài)位點（占總分析位點的12.65%），表明該基因具有高度的多態(tài)性。這主要與河西絨山羊常年生活在海拔1 400-5 564 m的干旱、寒冷、缺氧的嚴酷條件下，具有的適應性強、耐粗飼、抗病性強等特性有關。由于地理環(huán)境改變產(chǎn)生的選擇作用產(chǎn)生了物種的多樣性，不同環(huán)境中所接觸的病原體不同，所以其免疫系統(tǒng)要增加遺傳多樣性來應對這種情況，這是MHC對環(huán)境和病原體的適應性的體現(xiàn)。動物體只有具有多態(tài)的機體免疫系統(tǒng)才能適應千差萬別的外界環(huán)境。由于動物MHC起抗原呈遞作用、與免疫應答密切相關，因此作為主要編碼MHC肽結(jié)合區(qū)（Peptide-binding region，PBR）的DQA1基因也表現(xiàn)為豐富的多態(tài)性。新等位基因的出現(xiàn)可能與其所處的地理環(huán)境和山羊品種有關。

許多研究表明，DQA1與人類和家畜部分疾病的易感性和抗性有關，它能誘導強排斥反應并參與免疫調(diào)節(jié)［19，20］。Demurov等［21］報道莫斯科人2型糖尿病與DQA1*0301呈正相關。Lunden等［22］研究發(fā)現(xiàn)只有一種DQ單倍型與奶牛乳房炎易感性顯著相關。國外學者對高加索人群研究結(jié)果表明，反復自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）的發(fā)生與單倍型DQA1*0201-DQB1*0201、DQA1*0101-DQB1*0501、DQA1*0501-DQB1*0201相關［23］。我國林其德等［24］研究上海人群不明原因RSA患者，發(fā)現(xiàn)DQA1*01-DQB1*0604，0605單倍型可能是該病的易感單倍型。本試驗結(jié)果表明，GoLA-DQA1不同等位基因?qū)α鳟a(chǎn)的易感性和抗性存在差異。在相同的飼養(yǎng)管理及防疫條件下，不同表型間的等位基因分布差異顯著（P<0.05），病例組中等位基因GoLADQA1*A的頻率顯著高于正常組（P<0.05），等位基因GoLA-DQA1*H的頻率顯著低于正常組（P<0.05）。由此推測等位基因GoLA-DQA1*A與流產(chǎn)的易感性相關，GoLA-DQA1*H與流產(chǎn)抗性有關。但需進一步擴大試驗群體樣本量進行深入研究，以確定山羊流產(chǎn)的有效分子標記，為河西絨山羊抗病育種奠定良好的基礎。

4 結(jié)論

在河西絨山羊GoLA-DQA1基因第2外顯子中檢測到9個等位基因，其中GoLA-DQA1*B、GoLADQA1*E和GoLA-DQA1*H 3個為本研究首次發(fā)現(xiàn)。9個等位基因中存在42個核苷酸多態(tài)位點，占總分析位點的12.65%。其中轉(zhuǎn)換位點23個，顛換位點13個，轉(zhuǎn)換和顛換共存位點5個，插入位點1個。說明河西絨山羊GoLA-DQA1具有豐富的多態(tài)性。相關性結(jié)果表明，不同表型間的等位基因分布差異顯著（P<0.05），等位基因GoLA-DQA1*A可能與流產(chǎn)的易感性相關，GoLA-DQA1*H可能與流產(chǎn)抗性相關。

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