吳承菲 郭雙生 趙琦 孫建鋒

（1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048；2.中國航天員科研訓(xùn)練中心，北京 100094）

近年來，隨著國際空間站的建成和載人航天技術(shù)的進步，空間生命科學(xué)和空間生物技術(shù)領(lǐng)域的研究發(fā)展迅猛。有關(guān)微重力，最早是指空間飛行器在軌飛行時，離心力與地球引力相平衡，飛行器艙內(nèi)物體處于接近零重力的狀態(tài)，即微重力狀態(tài)［1］。對于微重力下的生物學(xué)研究可采用空間搭載和地面模擬方式進行。地面模擬微重力通常采用回轉(zhuǎn)器，主要是當(dāng)樣品在回轉(zhuǎn)器上時，生物體處于重力場中，受到恒定的重力矢量作用。但是，由于回轉(zhuǎn)器的轉(zhuǎn)動，作用于物體上的重力，方向不斷改變，由于重力方向改變，使生物體來不及感受重力的作用（每種生物都有一個最低感受時間或響應(yīng)時間閾值），而產(chǎn)生類似于微重力環(huán)境的現(xiàn)象［2］。通過空間飛行及回轉(zhuǎn)器研究表明，微重力會影響植物體的生長和發(fā)育，并會引起植物體生理特性的變化，同時相關(guān)基因的差異表達也會發(fā)生改變。20世紀90年代開始，隨著空間搭載機會的增加，空間實驗站的不斷建立，地面模擬實驗的不斷豐富和細胞分子生物學(xué)研究技術(shù)的創(chuàng)新，空間細胞生物學(xué)研究成果層出不窮。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥是野生的雙子葉草本植物，喜濕潤，不耐旱，生長周期短。將少量擬南芥Columbia種子在培養(yǎng)間（22℃，空氣相對濕度≥65%，16 h 光照/8 h 黑暗）進行擴繁，待成熟飽滿后獲取種子并密封，4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥幼苗培養(yǎng) 將擬南芥Columbia種子滅菌15 min后春化2 d，播種于1/2MS培養(yǎng)基上，22℃，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16 h 光照/8 h 黑暗，處理樣品放置水平回轉(zhuǎn)儀（中科院生物物理所提供）上，2 r/min；對照組（CK） 在實驗臺上培養(yǎng)。培養(yǎng)8 d 后采收。

1.2.2 幼苗株高、鮮重的測定 從生長第3天開始，測量處理和對照的擬南芥幼苗的株高、根長、下胚軸長度，直到第8天。在第8天測定幼苗的鮮重。

1.2.3 葉綠素含量測定 參照Arnon （1949） 的方法。待第8天采收后，用80%丙酮室溫、黑暗條件下提取葉綠素，分別于646 nm 和663 nm 處測定吸光度，根據(jù)Lichtenehaler和Wallbum 的修正公式計算葉綠素a、b、葉綠素（a+b） 的含量及葉綠素a/b的值。

1.2.4 活性物質(zhì)含量測定 待第8天擬南芥幼苗采收后，充分研磨，分別測定維生素C（Vc） 、超氧化物歧化酶（SOD） 、過氧化物酶（POD） 、過氧化氫酶（CAT） 的含量（南京建成公司提供的試劑盒）。丙二醛（MDA） 含量的測定采用硫代巴比妥酸（TAB） 法、脯氨酸（pro） 含量的測定采用酸性茚三酮法。

1.2.5 葉片鈣離子分布的檢測 鈣熒光探針指示劑法是利用與鈣離子結(jié)合探針并發(fā)出熒光的方法來檢測鈣離子的濃度，這種鈣離子指示劑有很高的鈣離子親和能力，能檢測出低濃度的鈣離子。按照文獻［3］采用Fluo-3/AM作為檢測細胞鈣離子濃度的熒光探針。利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察試驗材料。（1）取培養(yǎng)8 d的擬南芥根尖置于100 μL MS液體培養(yǎng)基中；（2）加入1 μL 1 mmol/L Fluo-3/AM，混勻；（3）4℃避光處理2 h，取出后用MS洗2次；（4）室溫下避光放置2 h；（5）激光共聚焦顯微鏡觀察，波長為488 nm，記錄并照相。

1.2.6 擬南芥幼苗RNA的吸光值的測定

1.2.6.1 總RNA的提取 擬南芥幼苗RNA 的提取采用Trizol法（Invitrogen 公司提供）。試驗步驟：（1） 稱取100 mg新鮮擬南芥組織加液氮速凍后充分研磨成干粉，轉(zhuǎn)入 1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol，混勻，室溫下靜置3-5 min；（2）每1 mL Trizol加200 mL氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振搖15 s，放置5 min；（3）4℃，12 000 r/min離心15 min；（4）RNA存在于上層水相，將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，做好標記；（5）加500 μL異丙醇，-20℃沉淀30 min以上，4℃，12 000 r/min離心10 min；（6）棄去上清，加入1 mL 75%乙醇（用DEPC水配制），洗滌沉淀物，4℃，12 000 r/min離心10 min；（7）吸棄乙醇，空氣中干燥5-10 min；（8）RNA略顯透明，加入30-50 μL RNase-free Water，充分溶解。

1.2.6.2 總RNA的定量與RNA純度檢測 （l）紫外分光光度計測定RNA的產(chǎn)量：測定RNA溶液的OD260，按照1個OD260=40 μg/mL計算；（2）RNA純度檢測：測定樣品在260 nm和280 nm下的吸光值，OD260/OD280的比值在2.0附近為佳。

2 結(jié)果

2.1 模擬微重力對擬南芥幼苗生長發(fā)育的影響

2.1.1 對幼苗向性的影響 觀察生長8 d的擬南芥幼苗，可以明顯看出，正常重力條件下的擬南芥幼苗莖向上生長，根直立向下生長；而模擬微重力條件下的幼苗生長沒有方向性，莖和根都呈現(xiàn)不定向生長，根呈彎曲狀（圖1），說明模擬微重力影響植物的生長方向。

圖1 SM條件下（A）和CK條件下（B）擬南芥幼苗圖

2.1.2 對幼苗株高的影響 分別對幼苗的株高、根長、下胚軸長度進行了測定，模擬微重力下生長8 d 的幼苗株高比對照低，在3-5 d 時，處理的幼苗的株高、根長比對照長，而5 d之后，處理的株高和根長都比對照短；而且，下胚軸長度比對照長約0.804 mm（表1），說明模擬微重力影響植物的生長。

2.2 模擬微重力對擬南芥幼苗生理特性的影響

2.2.1 對幼苗光合特性的影響 光合作用中葉綠體對光能的捕獲、傳遞和轉(zhuǎn)化主要是通過葉綠素a 和葉綠素b完成的。分別測定了生長8 d的處理和對照的幼苗的葉綠素含量，處理的幼苗的葉綠素a和葉綠素b的含量均高于對照組，但葉綠素a/b的比值有所下降。光合速率測定結(jié)果表明，對照與處理的光合速率無顯著差異，說明微重力環(huán)境會提高擬南芥的葉綠素含量，而對光合作用效率無顯著影響。

2.2.2 模擬微重力對幼苗活性物質(zhì)含量的影響 用試劑盒和紫外分光光度計分別測定維生素C（Vc） 、超氧化物歧化酶（SOD） 、過氧化物酶（POD） 、過氧化氫酶（CAT） 的含量。處理的Vc含量減少，而POD、SOD和CAT含量卻高于對照。而且，通過對丙二醛（MDA）和脯氨酸（pro）含量的測定發(fā)現(xiàn)，處理的丙二醛與脯氨酸含量明顯高于對照。

表1 模擬微重力（SM）與正常重力（CK）條件下擬南芥生理生化指標測定數(shù)據(jù)

2.3 模擬微重力影響幼苗葉片的鈣離子分布

Fluo-3熒光染料與游離鈣離子結(jié)合可發(fā)出綠色熒光，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，處理的擬南芥葉片細胞壁的綠色熒光十分明顯，如圖2所示。

圖2 正常重力條件下（A）與模擬微重力條件下（B）擬南芥葉肉細胞鈣離子分布

2.4 模擬微重力對基因表達的影響

生物體在重力改變的情況下，生長代謝、遺傳發(fā)育、生理特性及顯微結(jié)構(gòu)的變化都是由基因調(diào)控的。本實驗室在R平臺上用ANOVA的方法挑選出模擬微重力處理6 d的差異基因和模擬微重力處理1 d的差異基因?；蛐酒Y(jié)果表明，模擬微重力處理6 d后的擬南芥差異表達的基因有450個，上調(diào)表達201個，下調(diào)表達249個，上調(diào)倍數(shù)最大為4.25，下調(diào)倍數(shù)最小為0.37；在模擬微重力處理1 d后擬南芥差異表達的基因有365個，上調(diào)表達136個，下調(diào)表達229個，上調(diào)倍數(shù)最大為2.19，下調(diào)倍數(shù)最小為0.43。

3 討論

室外培養(yǎng)的擬南芥種子一般春季萌發(fā)，到夏季即種子成熟，因此，生殖生長延緩，生活周期過長，不利于加快實驗進程。而室內(nèi)培養(yǎng)是將種子播撒于營養(yǎng)土、蛭石、素沙按體積比1∶1∶1均勻混合的培養(yǎng)介質(zhì)中，該方法使用的培養(yǎng)介質(zhì)既有擬南芥苗期根系生長所需的透水和透氣性，又能為擬南芥后期生長提供養(yǎng)分，且水、肥和氣均供應(yīng)均衡一致，且室內(nèi)培養(yǎng)的成活率較高，生長健壯，生長發(fā)育進程快且整齊，因此能最好的發(fā)揮擬南芥?zhèn)€體小和生育期短的優(yōu)勢，降低生物實驗系統(tǒng)誤差。

許多文獻提出，微重力環(huán)境對于正常生長的植物來說是一個逆境條件，改變重力的大小和方向都會影響植物的代謝、生長、發(fā)育、繁殖及應(yīng)激反應(yīng)等［5，6］。植物在正常的重力下，根向下生長，莖向上生長。在微重力環(huán)境下，根的生長方向依種胚所處的方位而定。地上部生長取決于光源的位置，在微重力場中向光性彎曲更加明顯，因此，莖和根都呈現(xiàn)不定向生長，根呈彎曲狀。目前，已有多項研究表明模擬微重力會影響植物的細胞形態(tài)和植物細胞的亞顯微結(jié)構(gòu)［7］。有人報道，太空飛行的豌豆幼苗根細胞變長，表面積變大，而細胞核變小。有研究者［8］采用馬鈴薯、香石竹、草莓及人參果的試管幼苗作為試驗材料，分別置于正常重力環(huán)境中和模擬微重力環(huán)境中，待生長8 d后，對4種植物的電鏡切片觀察發(fā)現(xiàn)，模擬微重力對植物細胞亞顯微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響：細胞壁收縮呈不規(guī)則多角形，細胞之間聯(lián)結(jié)松散，而且葉綠體片層結(jié)構(gòu)明顯彎曲、疏松和膨化，并且變得模糊。線粒體表面的膜粗糙、嵴不明顯、結(jié)構(gòu)松散。Popova等［9］觀察了飛行10.5 d 和18 d 的小球藻細胞發(fā)現(xiàn)細胞分裂受到干擾，類囊體腔膨脹，葉綠體出現(xiàn)電子半透明區(qū)。同時，類囊體相對體積減小。黃偉等［8］觀察玉米在微重力下會導(dǎo)致細胞出現(xiàn)畸形核，這可能與細胞骨架遭到破壞有關(guān)。POD、SOD和CAT是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中的3種重要保護酶，它們能夠有效阻止活性氧在植物體內(nèi)的積累。因此，POD、SOD和CAT活性的升高反映出植物在逆境下，能通過自身防御機制對有害物質(zhì)做出保護性應(yīng)激反應(yīng)［10-12］。我們的試驗結(jié)果表明，模擬微重力處理后3種抗氧化酶活性均有不同程度的提高，表明擬南芥幼苗對微重力刺激作出了保護性應(yīng)激反應(yīng)。而Vc是植物體內(nèi)抗氧化的成分，體內(nèi)活性氧的增加會導(dǎo)致Vc的含量發(fā)生變化，Vc的抗氧化功能同樣可以防止活性氧對植物組織的破壞。在防御應(yīng)激過程中，植物體消耗了大量的Vc，因此，Vc含量的下降同樣也說明擬南芥幼苗對微重力刺激作出了保護性應(yīng)激反應(yīng)。MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，具有細胞毒性，能引起細胞膜功能紊亂［13］。模擬微重力處理后，擬南芥體內(nèi)活性氧含量增加，導(dǎo)致MDA的升高，說明模擬微重力類似于逆境刺激。因此，造成MDA升高。鈣離子是真核生物中調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使，鈣離子參與植物應(yīng)激、抗逆、抗病等一系列刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)［14，15］。有人研究了模擬微重力條件下的草莓和香石竹的株高、葉片數(shù)、葉綠素含量及光合速率發(fā)現(xiàn)，微重力對葉綠體的正常光合功能沒有顯著影響。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)，重力改變時，擬南芥的鈣離子分布和濃度也發(fā)生改變，進而引起一系列的生物效應(yīng)［15］。徐偉等［16］對微重力條件下蘆筍根尖鈣離子的分布的研究發(fā)現(xiàn)，微重力條件下根尖細胞鈣離子濃度比對照的鈣離子濃度低。本試驗結(jié)果顯示，模擬微重力環(huán)境下，擬南芥葉片的鈣離子濃度比對照的鈣離子濃度高，說明模擬微重力影響鈣離子的分布。這些結(jié)果表明鈣離子在植物的微重力效應(yīng)過程中起到很大的作用。但是，根和葉片在模擬微重力條件下的鈣離子分布狀況有所不同，很可能是由于重力方向發(fā)生改變，鈣離子在植物組織細胞中進行移動，如果集中移動到根部，葉片中就減少了鈣離子，如果集中移動到根部，葉片就減少了鈣離子。結(jié)果顯示，模擬微重力，促使鈣離子移動到了葉片細胞中，徐偉等僅對玉米根尖鈣離子分布進行了觀察，未對葉片鈣離子分布進行檢測，所以，本試驗的結(jié)果和前人并不矛盾。Mari 等［17］以水蕨屬作為試驗材料，對其孢子進行了不同時間（包括1、8和20 h）的模擬微重力處理，提取RNA并進行實時定量RT-PCR，然后比較分析芯片結(jié)果，通過基因表達分析發(fā)現(xiàn)，1 h處理的孢子的2 110個基因中有3.46%基因位點發(fā)生改變，其中37個基因明顯上調(diào)，25個基因下調(diào)表達；8 h 處理的孢子的2 486個基因中有5.91%發(fā)生改變，其中70個明顯上調(diào)表達，42個下調(diào)表達；經(jīng)20 h處理的孢子的2 797個基因中有5.20%發(fā)生改變，其中有53個上調(diào)表達，48個下調(diào)表達［18］。對人腎細胞進行空間搭載后發(fā)現(xiàn)，有1 632個基因表達發(fā)生了明顯改變［19］。Barjaktarovi?等［20］對7 g處理1 h的擬南芥愈傷組織進行了基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，200多個基因表達明顯上調(diào)，他們還通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)，超重1 h處理的愈傷組織中有28個蛋白發(fā)生了明顯改變。

4 結(jié)論

本研究有關(guān)基因芯片分析結(jié)果或許可以說明，上述這些生理指標差異，很可能與模擬微重力處理的差異表達有關(guān)，處理6 d上調(diào)表達201個，下調(diào)表達249個；處理1 d 差異表達的基因，上調(diào)表達136個，下調(diào)表達229個，或許這些差異表達的基因是由微重力處理引起的，研究結(jié)果尚需進一步驗證。

［1］ 王浩, 牛顏冰.航天育種機理的研究進展［J］. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2009, 29（2）：120-121.

［2］ Albrecht-Buehler G. The simulation of microgravity conditions on the ground［J］. ASGSB Bulletin, 1992, 5（2）：3-10.

［3］ Sobol M, Kordyum E. Distribution of calcium ions in cells of the root distal elongation zone under clinorotation［J］. Microgravity Sci Technol, 2009, 21（1-2）：179-185.

［4］ Zhao Q, Li J, Liu M. Effects of simulated microgravity on characteristics of photosynthesis in plant seedling［J］. Space Medicine & Medical Engineering, 2002, 15（2）：79-83.

［5］ 鄭景生.微重力下的植物生物學(xué)效應(yīng)與空間誘變育種研究［J］. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2003, 25（5） ：671-675.

［6］ 費翅鯤, 胡向陽, 崔大勇, 等.模擬微重力的植物生物學(xué)效應(yīng)［J］. 自然科學(xué)進展, 2002, 12（2） ：135-139.

［7］ 劉敏, 王亞林, 薛淮, 等.模擬微重力條件下植物細胞亞顯微結(jié)構(gòu)的研究［J］. 航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程, 1999, 12（5）：360-363.

［8］ 黃偉, 黃曉兵, 郭梅, 等.模擬微重力對玉米根尖細胞核的影響［J］.內(nèi)江師范學(xué)院學(xué)報, 2008, 23（4）：57-59.

［9］ Hilaire E, Guikema JA, Brown J, Gravit CS. Clinorotation affects soybean seedling morphology［J］. Physiology, 1995, 2：149-150.

［10］ Kochba J, Lvee S. Differences is peroxidase activity and isoenzymes in embryogenic and non-embryogenic shamouti orange ovular callus lines［J］. Plant Cell Physiology, 1977, 18：463-467.

［11］ Cai WM. Isozyme analysis of SOD of several plants species in simulate microgravity condition［J］. Acta Phytophysiologica Sinica, 2000, 26：137-142.

［12］ Hepler PK, Wayne RO. Calcium and plant development［J］. Annu Rev Plant Physiol, 1985, 36：397-439.

［13］ Zhao HC, Zhu T, Wu J, Xi BS. Effect of simulated microgravity on aged pea seed vigour and related physiological properties［J］. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces, 2003, 27：311-314.

［14］ Gilroy S, Jones RL. Gibberellic acid and abscisic acid coordinately regulate cytoplasmic calcium and secretory activity in barley aleurone protoplasts［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89（8）：3591-3995.

［15］ Hilaire E, Paulsen AO, Brown CS, et al. Microgravity and clinorotation cause redistribution of free calcium in sweet clover columella cells［J］. Plant Cell Physiol, 1995, 36：831-837.

［16］ 徐繼, 趙琦. 微重力對石刁柏根尖組織和細胞中鈣水平及分布的影響［J］. 生物物理學(xué)報, 1999, 15（2）：381-386.

［17］ Salmi ML, Roux SJ. Gene expression changes induced by space flight in single-cells of the fern Ceratopteris richardii［J］. Planta, 2008, 229：151-159.

［18］ Centis-Aubay S, Gasset G, Mazars C, et al. Changes in gravitational forces induce modifications of gene expression in A. thaliana seedlings［J］. Planta, 2003, 218：179-185.

［19］ Commission on Physical Sciences Mathematics and Applications National Research Council. Biological sciences and biotechnology microgravity research opportunities for the 1990s［R］. Conmittee on Microgravity Research Space Studies Board, 1999：62-75.

［20］ Barjaktarovi? ?, Babbick M, Nordheim A, et al. Alterations in protein expression of Arabidopsis thaliana cell cultures during hyper- and simulated micro-gravity［J］. Microgravity Sci Technol, 2009, 21：191-196.