張 秀 付雪嬌 王桂萍 程 凡，2 陳劍鋒

（1.三峽大學化學與生命科學學院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北宜昌 443002；2.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083）

宜昌潤楠（Machilus ichangensis Rehd.et Wils.）是樟科潤楠屬常綠植物［1］，主要產(chǎn)于湖北、四川、陜西南部和甘肅西部，資源十分豐富［2］.宜昌潤楠在我國傳統(tǒng)和民間醫(yī)藥典籍中有應用記載，莖、葉、皮藥用，治霍亂、吐瀉不止、抽筋及足腫，在三峽區(qū)域民間主要應用其治療各種皮膚炎癥、關節(jié)腫痛和風濕性疾病，療效顯著，且無明顯的毒副作用［3］.目前國內(nèi)外尚未見到有關宜昌潤楠化學成分和藥理作用的報道，臨床使用經(jīng)驗提示宜昌潤楠具有較好的抗炎效果，但其抗炎藥效的物質基礎和作用機制尚未闡明.本試驗采用佛波酯（PMA）誘導人單核細胞THP－1分化成巨噬細胞，再利用細菌脂多糖（LPS）刺激產(chǎn)生白介素1（IL－1β）、白介素6（IL－6）、腫瘤壞死因子（TNF－α）和一氧化氮（NO）等炎性細胞因子和炎性介質，構建炎癥細胞模型，觀察宜昌潤楠正丁醇提取物（MCB）對上述炎性細胞因子和介質的影響，初步探索其抗炎活性作用機制，為宜昌潤楠的民間藥用提供藥理學依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 細胞

THP－1細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心（編號：TCHu 57），按推薦的方法保存、傳代及培養(yǎng).

1.2 藥物與試劑

佛波酯PMA（CAS＃16561－29－8）購自Promega公司；脂多糖LPS（from Escherichia coli 0111：B4）購自Sigma－Aldrich；人IL－1βELISA 檢測試劑盒、人IL－6ELISA 檢測試劑盒以及人TNF－αELISA 檢測試劑盒購自達科為生物技術有限公司；人NO ELISA檢測試劑盒購自上海信然生物技術有限公司.

1.3 主要儀器

ELX800NB 酶標儀（BioTek）；倒置顯微鏡（Olympus CKX41）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo 3111）.

2 方法

2.1 潤楠正丁醇提取物的制備

取宜昌潤楠干燥枝葉1kg，常溫下95%乙醇浸提，減壓濃縮得浸膏103g，浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到正丁醇部位32g.正丁醇部位上大孔樹脂后用80%乙醇洗脫，洗脫液濃縮干燥，得潤楠正丁醇提取物（MCB）18g.

2.2 MCB對THP－1細胞生長狀況的影響

應用MTT 法測定MCB 對THP－1細胞的細胞毒性.步驟如下：將處于對數(shù)生長期的人單核細胞THP－1（2×105個／mL）接種于24孔細胞培養(yǎng)板中（1 mL／孔），12h后加入終濃度為100nM 的PMA，繼續(xù)培養(yǎng)48h，待細胞貼壁后分別添加：①正常細胞組：細胞培養(yǎng)孔中僅加入相同體積的完全培養(yǎng)基；②陽性藥物組：于細胞培養(yǎng)孔中加入終質量濃度為50μg／mL的絲裂霉素；③給藥組：于細胞培養(yǎng)孔中加入終質量濃度為50～1 600μg／mL 的MCB.每組6個復孔，藥物作用48h后OD490測定吸光度，根據(jù)公式：抑制率（1－給藥組OD490／正常組OD490）×100%計算抑制率.

2.3 MCB對炎性細胞因子分泌的影響

2.3.1 固定藥物濃度，觀察作用不同時間的MCB對炎性細胞因子分泌的影響

將處于對數(shù)生長期的人單核細胞THP－1（2×105個／mL）接種于24孔細胞培養(yǎng)板中（1mL／孔），12 h后加入終質量濃度為100nM 的PMA，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，待細胞貼壁后分別添加：①正常組，細胞培養(yǎng)孔中僅加入相同體積的完全培養(yǎng)基；②模型組，于細胞培養(yǎng)孔中加入終質量濃度為1μg／mL LPS；③給藥組，于細胞培養(yǎng)孔中加入終質量濃度為1μg／mL LPS以及800μg／mL 的MCB；37℃，5%CO2下培養(yǎng)不同時間后（2h、4h、8h、12h、24h等）收取細胞上清，ELISA試劑盒分別檢測IL－1β、IL－6、TNF－α和NO 的含量.根據(jù)公式：抑制率＝（1－給藥組濃度／模型組濃度）×100%測定抑制率.

2.3.2 固定藥物作用時間，觀察不同濃度的MCB對炎性細胞因子分泌的影響

將處于對數(shù)生長期的人單核細胞THP－1（2×105個／mL）接種于24孔細胞培養(yǎng)板中（1mL／孔），12 h后加入終質量濃度為100nM 的PMA，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，待細胞貼壁后分別添加：①正常組，細胞培養(yǎng)孔中僅加入相同體積的完全培養(yǎng)基；②模型組，于細胞培養(yǎng)孔中加入終質量濃度為1μg／mL LPS；③給藥組，于細胞培養(yǎng)孔中加入終質量濃度為1μg／mL LPS以及不同質量濃度的MCB（50～800μg／mL）；37℃，5%CO2下培養(yǎng)相同時間后同時收取細胞上清，ELISA試劑盒分別檢測IL－1β、IL－6、TNF－α和NO 的含量，計算MCB對相應細胞因子的抑制率.抑制率＝（1－給藥組濃度／模型組濃度）×100%測定抑制率.

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結 果

3.1 MCB對THP－1細胞生長狀況的影響

結果如圖1 所示，加入藥物后培養(yǎng)48h，發(fā)現(xiàn)1600μg／mL的MCB明顯抑制了細胞生長，與正常細胞相比，有顯著性差異，表明1 600μg／mL的MCB對THP－1細胞具有一定毒性.但50 ～800μg／mL 的MCB對THP－1細胞不表現(xiàn)毒性，與未加藥的正常細胞相比，反而促進了細胞生長，表明MCB 對THP－1細胞的安全質量濃度應該在800μg／mL及以下.

圖1 宜昌潤楠正丁醇提取物（MCB）對THP－1細胞生長狀況的影響

3.2 MCB對IL－1β分泌的影響

3.2.1 加藥后不同時間MCB對IL－1β分泌的影響加入800μg／mL的MCB后，于37℃，5%CO2下培養(yǎng)2、4、8、12、24h后收取細胞上清.每個時間段設3個復孔；ELISA 試劑盒檢測IL－1β的含量.結果如圖2所示，隨著LPS刺激時間的延長，IL－1β的分泌量逐漸增大，在12h時達到頂峰.在加入藥物2h以內(nèi)，與模型組相比，800μg／mL的MCB能極顯著地抑制IL－1β的分泌（P＜0.001）.但隨著時間的增加，在加藥4h及以后MCB均沒有表現(xiàn)出抑制IL－1β分泌的活性.

圖2 800μg／mL的MCB作用不同時間（2～24h）對IL－1β分泌的影響

3.2.2 不同質量濃度的MCB對IL－1β分泌的影響

加入不同質量濃度的MCB（50～800μg／mL），每個濃度設3 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)2h 后取細胞上清，ELISA 試劑盒檢測IL－1β的含量.結果圖3所示，隨著藥物濃度的增大，MCB 對THP－1 細胞分泌L－1β的抑制率也隨之增大，當MCB質量濃度達到800μg／mL時，有最大抑制率，約為75%左右.

圖3 不同質量濃度的MCB對IL－1β分泌的抑制率（作用時間：2h）

3.3 MCB對IL－6分泌的影響

3.3.1 加藥后不同時間MCB對IL－6分泌的影響

加入800μg／mL的MCB后，于37℃，5%CO2下培養(yǎng)2、4、8、12、24h后收取細胞上清.每個時間段設3個復孔；ELISA 試劑盒檢測IL－6的含量.結果如圖4所示，LPS刺激4h后，THP－1細胞開始分泌IL－6，隨著刺激時間的延長，IL－6的分泌量逐漸增大.與模型組相比，加藥組（800μg／mL 的MCB）的IL－6含量在不同的時間段均明顯下降，表明MCB對LPS誘導的IL－6有極顯著的抑制作用（P＜0.001）.

圖4 800μg／mL的MCB作用不同時間（2～24h）對IL－6分泌的影響

3.3.2 不同質量濃度的MCB對IL－6分泌的影響

加入不同濃度的MCB（50～800μg／mL），每個濃度設3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)8h 后取細胞上清，ELISA試劑盒檢測IL－6的含量.結果圖5所示，可見隨著藥物濃度的增大，MCB對THP－1細胞分泌L－6的抑制率也隨之增大，當MCB 質量濃度達到800μg／mL時，有最大抑制率，約為98%左右.

3.4 MCB對TNF－α分泌的影響

3.4.1 加藥后不同時間MCB對TNF－α分泌的影響

圖5 不同質量濃度的MCB對IL－6分泌的抑制率（作用時間：8h）

加入800μg／mL的MCB后，于37℃，5%CO2下培養(yǎng)2、4、8、12、24h后收取細胞上清.每個時間段設3個復孔；ELISA 試劑盒檢測TNF－α的含量.結果如圖6所示，LPS 刺激THP－1 細胞后開始分泌TNFα，隨著刺激時間的延長，TNF－α的分泌量逐漸增大.與模型組相比，加藥組（800μg／mL的MCB）的TNFα含量在不同的時間段均明顯下降，表明MCB 對LPS誘導的TNF－α 有極顯著的抑制作用（P ＜0.001）.

圖6 800μg／mL的MCB作用不同時間（2～24h）對TNF－α分泌的影響

3.4.2 不同質量濃度的MCB對TNF－α分泌的影響

加入不同質量濃度的MCB（50～800μg／mL），每個濃度設3 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h 后取細胞上清，ELISA 試劑盒檢測TNF－α的含量.結果圖7所示，可見隨著藥物濃度的增大，MCB 對THP－1 細胞分泌TNF－α的抑制率也隨之增大，當MCB 質量濃度達到800μg／mL時，有最大抑制率，約為90%左右.

圖7 不同質量濃度的MCB對TNF－α分泌的抑制率（作用時間：4h）

3.5 MCB對NO 產(chǎn)生的影響

3.5.1 加藥后不同時間MCB對NO 產(chǎn)生的影響

加入800μg／mL的MCB后，于37℃，5%CO2下培養(yǎng)8、12、24、36、72h后收取細胞上清.每個時間段設3個復孔；ELISA 試劑盒檢測NO 的含量.結果如圖8所示，LPS 刺激THP－1 細胞36h 后開始產(chǎn)生NO，隨著刺激時間的延長，NO 的含量逐漸增大.與模型組相比，加藥組（800μg／mL 的MCB）在藥物作用72h后能極顯著地抑制NO 的產(chǎn)生（P＜0.001）.

圖8 800μg／mL的MCB作用不同時間（2～24h）對NO 分泌的影響

3.5.2 不同質量濃度的MCB對NO 產(chǎn)生的影響

加入不同質量濃度的MCB（50～800μg／mL），每個濃度設3 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)72h 后取細胞上清，ELISA 試劑盒檢測NO 的含量.結果圖9所示，可見隨著藥物濃度的增大，MCB 對THP－1細胞產(chǎn)生NO的抑制率也隨之增大，當MCB質量濃度達到800μg／mL時，有最大抑制率，約為50%左右.

圖9 不同質量濃度的MCB對NO 分泌的抑制率（作用時間：72h）

4 討 論

炎癥是機體對外來刺激產(chǎn)生的一種病理反應過程，癥狀表現(xiàn)為局部的紅腫熱痛，病理檢查可發(fā)現(xiàn)有大量炎癥細胞，如粒細胞、巨噬細胞的局部浸潤和組織壞死，在這一過程中，一些細胞因子起到重要的促進作用，如IL－1β、IL－6、和TNF－α以及NO 等介質可促進炎癥細胞的聚集、活化和炎癥介質的釋放，加重炎癥癥狀.在許多炎癥性疾病中都可檢測到上述細胞因子的水平升高［4］.當重度感染時，腹腔巨噬細胞受到大量LPS刺激，產(chǎn)生大量的IL－1β、IL－6和TNF－α，它們相互誘生，相互協(xié)同.由于這些細胞因子的過量存在，進一步激活多形核白細胞和內(nèi)皮細胞等效應細胞，并釋放氧自由基、蛋白酶等，加速花生四烯酸代謝，釋放血栓素A2、前列腺素、白三烯等炎癥介質，形成瀑布效應，導致過度炎癥反應［5］.目前己開始利用細胞因子抑制劑治療炎癥性疾病，例如利用IL－1β的受體拮抗劑和抗TNF－α抗體治療內(nèi)毒素性休克、類風濕關節(jié)炎等，收到了初步療效［6－7］.

宜昌潤楠是三峽區(qū)域一種常見的民間藥材，多用來治療關節(jié)腫痛和風濕類風濕性關節(jié)炎以及各種皮膚瘙癢癥.采集新鮮的枝葉搗碎后外敷患部或水煮液口服，可有效緩解局部紅腫熱痛的癥狀，且極少發(fā)生毒副作用或其它不良反應，深受當?shù)乩习傩盏南矏?但目前國內(nèi)外尚未見到有關宜昌潤楠化學成分和藥理作用的報道，根據(jù)其臨床使用經(jīng)驗和用藥方式，推測其可能具有較好的抗炎效果.本研究以宜昌潤楠正丁醇提取物為研究對象，初步探索其抗炎的物質基礎和作用機制，為宜昌潤楠這一民間藥物的應用奠定基礎.根據(jù)試驗結果，發(fā)現(xiàn)其對細胞基本無毒性，高濃度的正丁醇提取物甚至還可以促進細胞的生長，這可能是其臨床應用毒副作用極小的原因之一.另外，正丁醇提取物雖然對IL－1β的抑制效果不明顯，但對炎性細胞因子IL－6和TNF－α以及炎性介質NO 的產(chǎn)生均具有極顯著的抑制效果，隨著劑量的增加，其抑制效果也隨之增大，可以初步確定抑制炎癥反應過程中IL－6、TNF－α和NO 的產(chǎn)生是其發(fā)揮抗炎活性的原因之一.但本研究對其抗炎活性的評價并不全面，諸如對前列腺素、白三烯、血栓素A2、氧自由基釋放等均未評價，這也是需要進一步研究的地方.

［1］ 中國科學院植物研究所.中國高等植物科屬檢索表［M］.北京：科學出版社，1979：187.

［2］ 李錫文.中國植物志：第三十一卷［M］.北京：科學出版社，1982：7－14.

［3］ 江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典［M］.上海：上?？茖W技術出版社，1977：114，1009，1423.

［4］ Charles N Serhan，John Savill.Resolution of Inflammation：the Beginning Programs the End［J］.Nature Immunology，2005，6：1191－1197.

［5］ Nathan，Carl.Points of Control in Inflammation［J］.Nature，2002，420：846－852.

［6］ Lennard AC.Interleukin－1 Receptor Antagonist［J］.Crit Rev Immunol，1995，15（1）：77－105.

［7］ Marc Feldmann，Ravinder N.Maini.Anti－TNF－αTherapy of Rheumatoid Arthritis：What Have we Learned？［J］.Annual Review of Immunology，2001，19：163－196.