張 麗 鄧國健 尹小娥 陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院(咸陽712000)
解毒通脈膠囊處方來源于臨床經(jīng)驗方,由黃連、三七、蓮子心、全瓜蔞、半夏、萊菔子、丹參和赤芍八味中藥組成,具清熱解毒、化痰祛瘀、宣痹通脈之功效,臨床用于治療熱毒痰瘀型冠心病不穩(wěn)定型心絞痛。制劑中成分復(fù)雜,為有效控制本品的質(zhì)量,對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行了定性和定量研究,制定了三七、赤芍、丹參的薄層鑒別[1],并采用高效液相色譜法對其所含有效成分鹽酸小檗堿[2,3]進行了含量測定。
1.1儀器 ZB-1D智能藥物崩解儀(上海);D101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永鑫實驗設(shè)備廠);水分測定儀(上海);梅特勒電子天平(萬分子一);L-2130高效液相色譜儀(日本日立L-2400檢測器,EZStart 工作站),Diamonsil C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱。
GB204型萬分之一天平(瑞士),KH-400KED 型超聲波清洗機(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。
1.2 試藥 本品項下所用樣品為由陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院自制(批號:101220、101225、101230);所用化學(xué)試劑均為分析純;硅膠G(青島海洋化工廠生產(chǎn));鹽酸小檗堿對照品、芍藥苷對照品、三七對照藥材、丹參對照藥材(批號依次為:110713-200208、0736-200414、120941-200405、120923-200408中國藥品生物制品檢定所)。樣品乙腈(美國Fisher公司)為色譜純,水為二次重蒸水,其余試劑均為分析純。
2.1 三七定性鑒別 取本品內(nèi)容物5g,研細,加甲醇30mL,超聲40min,濾過,濾液置水浴上蒸干,殘渣加水10mL使溶解,移至分液漏斗中,用水飽和的正丁醇萃取3次(20mL、10mL、10mL),合并正丁醇液,用正丁醇飽和的水洗滌2 次(10mL、10mL),棄去水溶液,正丁醇液置水浴上蒸干,殘渣加甲醇1mL使溶解,得供試品溶液。陰性供試品溶液的制備:以處方中藥味比例和制備工藝制成不含三七的空白樣品,再按供試品制備方法處理,制成陰性對照溶液。取三七對照藥材0.5g,加70%乙醇約20mL,加熱提取1h,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇0.2mL使溶解,得對照藥材溶液。照薄層色譜法[1]試驗吸取上述三種溶液各10μl分別點于硅膠G 薄層板上,各點10uL,以氯仿—甲醇—正丁醇—水(2∶1∶4∶2)10℃以下放置12h以上的下層溶液為展開劑,預(yù)飽和20min,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸溶液,加熱使斑點清晰,供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上有相同顏色的主斑點。
2.2 赤芍定性鑒別 取本品內(nèi)容物5g,加乙醇25mL,超聲提取30min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇2mL 使溶解,得供試品溶液。以處方中藥味比例和制備工藝制成不含赤芍的空白樣品,再按供試品制備方法處理,制成陰性對照溶液。取芍藥苷對照品,加甲醇制成lmL 含lmg的溶液,得對照品溶液。照薄層色譜法[6]試驗吸取上述三種溶液各10μL分別點于硅膠G 薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑,展開,取出,涼干,噴以5%香草醛硫酸溶液,加熱至斑點清晰。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的主斑點。
2.3 丹參定性鑒別 取本品內(nèi)容物5g,研細加乙醚30mL,超聲20min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇1mL 使溶解,得供試品溶液。以處方中藥味比例和制備工藝制成不含丹參的空白樣品,再按供試品制備方法處理,制成陰性對照溶液。取丹參對照藥材1g,同供試品法制備,得丹參對照藥材溶液。照薄層色譜法[6]試驗吸取上述三種溶液各10μL分別點于硅膠G 薄層板上,以苯-甲醇(19∶1)為展開劑,展開,取出,晾干。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的主斑點,陰性無干擾。
黃連為方中君藥,現(xiàn)代藥理研究表明,黃連改善微循環(huán)、抗心律失常,其含有的鹽酸小檗堿能抑制血清游離脂肪酸的增高,降低梗死后病理性Q 波的發(fā)生率,對缺血性心肌具有保護作用;具有抗血小板聚集、降壓、降血脂作用。因此本研究以其主要成分鹽酸小檗堿為指標(biāo)成分進行含量測定。
3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 流動相∶乙腈-0.05mmol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100mL 中加十二烷基磺酸鈉0.4g,再以磷酸調(diào)節(jié)pH 值為4.0);檢測波長345nm,流速1.0mL/min柱溫:室溫。在此條件下,理論板數(shù)以鹽酸小檗堿峰計算為5000(附圖1),樣品中鹽酸小檗堿得到良好分離(附圖2),缺黃連空白樣品鹽酸小檗堿在峰處無吸收(附圖3),不影響本品的測定。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)附圖
圖1 鹽酸小檗堿對照品HPLC色譜圖
圖2 解毒通脈膠囊樣品HPLC色譜圖
圖3 解毒通脈膠囊缺黃連陰性HPLC色譜圖
3.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品10mg,加甲醇制成每1ml含0.01mg的溶液,即得。
3.3 供試品溶液制備 取本品裝量差異項下的內(nèi)容物,混勻,取約0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25mL,超聲處理30min(功率250W,頻率40kHz),放冷,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液1mL,置10mL 量瓶中,加甲醇到刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。
3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 分別精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液(C=0.01mg/mL)3、5、10、15、20μL,按上述色譜條件,注入液相色譜儀,測定。以面積對進樣量(μg)回歸,得回歸方程,A=15775904.6653C+82297.1055,相關(guān)系數(shù)R2=0.9991,表明鹽酸小檗堿在0.03~0.20μg之間線性范圍良好。
3.5 精密度實驗 精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液(濃度0.01mg/mL)5μl,重復(fù)進樣5次,計算出RSD%=0.21%,表明該方法精密度良好。
3.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取本品(批號:101220)內(nèi)容物適量,按供試品溶液制備項下的方法制備供試品溶液,精密吸取供試品溶液5μl,每隔2h測定1次(0、2、4、6、8、10h),分別進行測定,結(jié)果表明供試品溶液穩(wěn)定性良好,RSD%=0.43%(n=6)。
3.7 重復(fù)性試驗 取本品(批號:101220)6 份,按供試品溶液制備方法,制備樣品溶液,并依據(jù)上述色譜條件,精密吸取各樣品溶液5ul,進樣,測定計算含量,測得鹽酸小檗堿的平均含量為7.3166mg/粒,RSD%=0.50%,表明本品重復(fù)性良好。
3.8 加樣回收試驗 取已知含量的樣品(批號:101220,C=7.3166mg/粒,即C=18.2915mg/g)6份,分別精密加入鹽酸小檗堿對照品適量,按供試品溶液的制備方法制備加樣回收供試品溶液,測定鹽酸小檗堿的含量,計算回收率結(jié)果見表1。
表1 回收率試驗結(jié)果
3.9 樣品測定 按供試品溶液項下的方法制備供試液,精密吸取對照品溶液、供試品溶液各5μL,進樣測定,每批樣品平行測定兩次,結(jié)果見表2。
表2 樣品測定結(jié)果
經(jīng)過3批樣品的測定結(jié)果,結(jié)合《中國藥典》(2010 年版一部)黃連藥材項下鹽酸小檗堿的含量限度規(guī)定(含鹽酸小檗堿不得少于5.5%)及其它影響因素,暫定本品每粒含黃連以鹽酸小檗堿(C20H18CLNO4)計,不得少于6mg/粒。
4.1 檢測波長的選擇 取鹽酸小檗堿對照品適量,用甲醇溶解,用紫外分光光度計于200~400nm 范圍內(nèi)掃描,繪制吸收光譜圖,結(jié)果混合溶液在345nm 處有最大吸收,故選擇345nm 為檢測波長。
4.2 根據(jù)三批樣品的實測數(shù)據(jù) 結(jié)合原料黃連藥材的含量,又考慮到中藥材受產(chǎn)地、氣候的影響較大及大生產(chǎn)實際情況,暫定本品每1g含黃連以鹽酸小檗堿計不得少于6mg/粒。
[1] 中國藥典編委會.中國藥典[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:148.
[2] 王秀萍,陳召暉,夏尚全.鹽酸小檗堿及其制劑含量測定方法研究概況[J].中草藥,1998,29(2)∶132.
[3] 王志朝,李 強,匡長春.二妙顆粒的制備與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥房,2007,18(12):908.
[4] 中國藥典編委會.中國藥典[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:附錄34.