楊小青, 盧虹玉, 李延平, 劉 義

(1. 廣東醫(yī)學(xué)院 廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室, 廣東 湛江 524023; 2. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)品加工廣東普通高校重點實驗室, 廣東 湛江 524045)

羊棲菜(Sargassum fusiforme)是一種褐藻門馬尾科植物, 多分布在我國沿海, 已有大規(guī)模人工養(yǎng)殖[1], 有較高的食用和藥用價值, 是重要的經(jīng)濟(jì)海藻[2]。近年來, 隨著海藻資源開發(fā)利用研究的不斷發(fā)展, 羊棲菜因富含多糖、多酚、萜類等多種生物活性成分而引起了人們的關(guān)注?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明, 羊棲菜及其提取物具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血糖等多種功效[3]。

研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜含有較高的褐藻多酚(phlorotannin), 可占藻體干質(zhì)量的2%, 僅次于海黍子[4]。褐藻多酚是主要存在于褐藻類植物中的一類獨特的次生化合物, 其基本結(jié)構(gòu)單元是間苯三酚[5]。研究表明, 羊棲菜褐藻多酚具有卓越的抗氧化和自由基清除能力[6-7]。由于越來越多的證據(jù)表明, 自由基參與許多疾病的病理過程, 從而誘發(fā)如心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性等疾病[8]。因此,尋找天然來源的自由基清除劑和抗氧化劑對于該類疾病的防治具有重要意義。目前有關(guān)羊棲菜多酚的活性報道多限于粗提物, 未見進(jìn)一步的研究[9-11]。本文對羊棲菜褐藻多酚(SFP)的粗提物進(jìn)行了精制純化, 并檢測不同分子質(zhì)量SFP餾分的體外自由基清除活性, 旨在尋找自由基清除效果好的SFP組分, 為羊棲菜的開發(fā)利用提供更詳實的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

1.1.1 儀器

SHZ-D()Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司); EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(TOKYO RIKAKIKAI CO.LTD JAPAN); DLSB-5/25低溫冷卻循環(huán)泵(河南斯泰儀器有限公司); SKY-1102C恒溫培養(yǎng)搖床(上海蘇坤); 電子天平BS210S(北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司); himacCRⅡ高速離心機(jī)(HITACHI); EYELA FDU-1100冷凍干燥儀(TOKYO RIKAKIKAI CO.LTD JAPAN); UV2550紫外分光光度(SHIMADZU)。

1.1.2 材料

羊棲菜購于浙江溫州三豐水產(chǎn)食品有限公司; DPPH(1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼)購于日本東京株式會社; VE、沒食子酸(GA)、Vc均購于美國Sigma公司; 羥自由基與超氧陰離子試劑盒購于南京建成生物工程研究所, 其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同分子質(zhì)量羊棲菜褐藻多酚的制備

將所購羊棲菜陰干后用打粉機(jī)打磨成粉, 稱取干粉480 g用80%甲醇按1 : 10室溫浸提3次, 每次12 h, 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇, 經(jīng)正己烷、乙酸乙酯萃取后獲得水相和乙酸乙酯相SFP提取物, 兩相分別過截留分子質(zhì)量為30 000、10 000及5 000的超濾膜包, 獲得水相分子質(zhì)量大于30 000(SFPW1)、10 000～ 30 000(SFPW2)、50 00～10 000(SFPW3)、小于 5 000(SFPW4)以及乙酸乙酯相分子質(zhì)量大于 30 000(SFPO1)、10 000～30 000(SFPO2)、5 000～ 10 000(SFPO3)、小于5 000(SFPO4)共8個組分, 經(jīng)冷凍干燥后留待備用。

1.2.2 多酚含量的測定

采用Folin－Ciocalteu法[12]測定各組分多酚含量。取10 mL棕色容量瓶, 加入1 mL樣品, 2 mL Folin-Ciocalteu試劑搖勻, 2 min后加入12 mol/L的Na2CO3溶液6 mL, 混合充分后于暗處靜置60 min, 于765 nm處測定吸光度。以GA為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 各組分多酚含量以其在羊棲菜總酚中所占質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示。

1.2.3 總抗氧化能力的測定

采用普魯士藍(lán)法[13]檢測各組分的總抗氧化能力。取10 mL容量瓶, 加入樣品1 mL, 去離子水 5 mL, 1 mol/L鹽酸0.2 mL, 1%鐵氰酸鉀1.5 mL, 1%十二烷基硫酸鈉(SDS)0.5 mL, 0.2%六水合三氯化鐵0.5 mL, 定容至10 mL, 室溫放置30 min后于750 nm處測定吸光度值。以GA為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 在同一濃度下(3 mg/L)比較Vc、VE及SFP在750 nm處吸光度。

1.2.4 DPPH清除率的測定

稱取10 mg DPPH置于100 mL棕色容量瓶中, 用無水乙醇定容至100 mL, 配制成濃度為100 mg/L DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液。將GA、Vc、VE及SFP分別配制成不同的濃度梯度。取2 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液, 加入2 mL 配制好的樣品混勻反應(yīng)60 min后, 以50% 乙醇為空白對照, 于527nm 處測吸光度值為A, 另取2 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液加入2 mL去離子水按上法測吸光度值為A0, 清除率= (A0-A)/A0×100%。

1.2.5 羥自由基清除率的測定

將GA、Vc、VE及SFP分別配制成不同的濃度梯度, 以蒸餾水代替樣品作空白按試劑盒說明進(jìn)行操作, 測得吸光度值為A0, 測得樣品吸光度值為A, 清除率=(A0-A)/A0×100%。

1.2.6 抗超氧陰離子自由基的測定

將GA、Vc、VE及SFP配制成40 mg/L的樣品, 按試劑盒說明測得吸光度值為A, 蒸餾水代替樣品測得吸光度值為A0, 清除率=(A0-A)/A0×100%。

2 結(jié)果

2.1 不同分子質(zhì)量SFP含量

不同分子質(zhì)量SFP含量結(jié)果如表1。各組分含量以其在羊棲菜提取物總酚中所占質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示。水相各組分多酚含量明顯比乙酸乙酯相高, SFPW1含量最高, 兩相中各組分多酚含量隨著分子質(zhì)量的降低而逐漸降低。

表1 不同分子質(zhì)量SFP的含量 Tab. 1 Content of SFP with different molecular weight

2.2 不同分子質(zhì)量SFP總抗氧化能力

在同一濃度3 mg/L下比較各組分的總抗氧化能力, 結(jié)果見圖1。乙酸乙酯相各組分的總抗氧化能力均強(qiáng)于水相, 其中SFPO4總抗氧化能力最強(qiáng), 相當(dāng)于2.36 mg/L的GA, 強(qiáng)于VE及Vc; 除SFPW2外其余組分總抗氧化能力均介于Vc與GA之間。這樣的結(jié)果表明羊棲菜可作為天然抗氧化劑的來源。

2.3 不同分子質(zhì)量SFP對DPPH的清除率

不同分子質(zhì)量SFP對DPPH的清除率及IC50值見表2。由表2可知各組分對DPPH的清除率均能達(dá)到平臺期, 但與陽性對照比各組分對DPPH沒有突出的清除能力。在20 mg/L濃度下比較各組分清除率發(fā)現(xiàn)SFPO1對DPPH清除能力最強(qiáng), 清除率達(dá)到77.2%; SFPW3最弱, 清除率僅為50.2%。比較各組分清除50% DPPH所需濃度可知, SFPO1最低, 為10.1 mg/L, 優(yōu)于VE; 其他組分均高于陽性對照, 其中SFPO4最高, 達(dá)到21.4 mg/L。

2.4 不同分子質(zhì)量SFP對羥自由基的清除能力

不同分子質(zhì)量SFP對羥自由基的清除率及IC50值見表3。由表3可見, 不同分子質(zhì)量SFP對羥自由基的清除能力均好于陽性對照; 在20 mg/L濃度下, SFPO1與SFPO2對羥自由基清除能力相當(dāng), 清除率分別為77.6%和77.1%, SFPW2清除能力最弱, 清除率只有25.4%。由表3可知, 乙酸乙酯相對羥自由基的清除能力明顯強(qiáng)于水相; SFPO1對羥自由基的清除能力最好, IC50為9.04 mg/L。

圖1 3 mg/L濃度下不同分子質(zhì)量SFP總抗氧化能力 Fig. 1 Total antioxidant capacity of SFP with different molecular weight at the concentration of 3 mg/L

表2 不同分子質(zhì)量SFP對DPPH的清除率及IC50值 Tab. 2 Scavenging effect and IC50 values of SFP with different molecular weight on DPPH

表3 不同分子質(zhì)量SFP對羥自由基的清除率及IC50值 Tab. 3 Scavenging effect and IC50 values of SFP with different molecular weight on hydroxyl free radical

2.5 不同分子質(zhì)量SFP抗超氧陰離子自由基的能力

在40 mg/L濃度下比較各組分對超氧陰離子自由基清除率結(jié)果見圖2。乙酸乙酯相SFP對超陰離子的清除能力明顯強(qiáng)于水相, 水相各組分對超氧陰離子清除能力無差別。SFPO1對超氧陰離子的清除能力最強(qiáng), 強(qiáng)于陽性對照, 清除率達(dá)到18.6%; 其余組分均高于GA和Vc。

圖2 40 mg/L濃度下不同分子質(zhì)量SFP對超氧陰離子自由基的清除能力 Fig.2 Scavenging ability of SFP with different molecular weight on super anion radical at the concentration of 40 mg/L

3 分析與討論

DPPH·是一類較為穩(wěn)定的自由基, 屬于芳香類自由基, 其較長的半衰期使該方法保持了良好的重現(xiàn)性, 應(yīng)用DPPH進(jìn)行定量分析簡便、快速且不受葡萄糖等雜質(zhì)的干擾[14]。因此, DPPH法是一種評價天然抗氧化劑氧化活性快速、簡便、靈敏可行的方法, 在國內(nèi)外應(yīng)用廣泛[15-16]。O2-·不僅自身具有毒性, 而且可以經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其他活性氧自由基, 進(jìn)一步對生物體產(chǎn)生損傷作用, 且停留時間較長。超氧陰離子自由基是生物活性最高的氧中心自由基之一, 它在生命過程和化學(xué)反應(yīng)中作為電子受體, 形成不同的活性氧自由基鏈中的第一個自由基, 經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其他的氧自由基[17]。在各種活性氧自由基中, 羥自由基的反應(yīng)活性最強(qiáng)(二階速率: 10-1010/M/S), 對機(jī)體危害最大, 因為·OH是僅次于F- 的強(qiáng)氧化劑, 幾乎可以和所有的細(xì)胞組分(核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等)發(fā)生反應(yīng)[18]。可見這兩種自由基具有較大的危害, 清除O2-·和·OH具有重要的意義。

實驗中發(fā)現(xiàn)羊棲菜褐藻多酚主要以高分子質(zhì)量形式存在, 而這與褐藻多酚結(jié)構(gòu)的特點有關(guān)。魏玉西等[5]在報道中提到, 褐藻多酚中間苯三酚連接方式及單體數(shù)量的不同, 導(dǎo)致了褐藻多酚化合物的結(jié)構(gòu)差異, 酚羥基的還原性是酚類化合物的共性之一,故Folin－Ciocalteu法中磷鉬酸和磷鎢酸被還原的程度不同而顏色不同, 所得樣品含量亦有差異, 而這都與樣品的結(jié)構(gòu)密切相關(guān), 高分子質(zhì)量褐藻多酚以間苯三酚單體多聚形成, 能作為氫供體的酚羥基比低分子質(zhì)量褐藻多酚多, 測得的高分子質(zhì)量褐藻多酚含量高。

對所得SFP 8個組分總抗氧化能力及對DPPH、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力的檢測研究后發(fā)現(xiàn), SFPO1的綜合抗氧化活性最好, 甚至對羥自由基與超氧陰離子的清除能力強(qiáng)于沒食子酸、VE和Vc。林超等[19]通過對BEL-7402人肝癌細(xì)胞株和A-549人肺癌細(xì)胞株的抑制活性篩選實驗,證明鼠尾藻中高相對分子質(zhì)量的海藻多酚抗腫瘤作用強(qiáng)于低相對分子質(zhì)量海藻多酚。他們還發(fā)現(xiàn)鼠尾藻和海黍子中高分子質(zhì)量多酚的抑菌作用好于低分子質(zhì)量多酚。魏玉西等[20]研究了鼠尾藻和海黍子兩種褐藻中高相對分子質(zhì)量褐藻多酚的抗氧化活性, 結(jié)果表明, 其對羥自由基,超氧陰離子和DPPH均有很高的清除效率。Blunden 等[21]從泡葉藻和墨角藻分離出具有裂解質(zhì)粒DNA、抑制某些酶等生物活性的高相對分子質(zhì)量褐藻多酚?？梢姼叻肿淤|(zhì)量的褐藻多酚在多種活性上比低分子質(zhì)量褐藻多酚更具優(yōu)勢, 這與本實驗結(jié)果相符。

本實驗對不同分子質(zhì)量段SFP抗氧化活性的研究, 證實羊棲菜褐藻多酚會因為分子質(zhì)量大小和溶劑的不同而表現(xiàn)出不同的抗氧化活性。在已得到羊棲菜褐藻多酚組分中乙酸乙酯萃取相分子大于 30 000的綜合抗氧化活性最好, 對于部分自由基的清除能力甚至強(qiáng)于沒食子酸、VE和Vc。為下一步的分離SFP得到高純度、高活性的天然抗氧化劑提供了依據(jù)。

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