劉志媛, 周俊如, 崔玉兵, 鄭陣兵, 王 珺

(海南大學(xué) 海洋學(xué)院, 海南 ?？?70228)

微藻是一類個(gè)體微小的單細(xì)胞或多細(xì)胞植物, 能夠有效地利用太陽(yáng)能, 通過光合作用將無機(jī)物轉(zhuǎn)化為脂類、蛋白質(zhì)、多糖及色素等高附加值的代謝產(chǎn)物。微藻用途廣泛, 不僅是魚、蝦、貝類幼體或成體的直接或間接的活餌料, 還是藥品和保健品的原料[1]。此外, 含油量高的微藻被認(rèn)為是生物柴油的理想生物原料[2-4]。

海南光熱充足, 微藻資源豐富, 具有開發(fā)微藻產(chǎn)業(yè)的巨大優(yōu)勢(shì)。篩選微藻資源, 研究其生物學(xué)性狀, 優(yōu)化其培養(yǎng)條件, 是微藻資源開發(fā)和利用的必要前提。溫度是影響微藻生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物積累的關(guān)鍵環(huán)境因子之一, 因而溫度培養(yǎng)條件最佳點(diǎn)的選擇是微藻資源評(píng)價(jià)以及微藻生物質(zhì)生產(chǎn)高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵。然而微藻最適溫度培養(yǎng)條件選擇是一項(xiàng)極其繁瑣和耗時(shí)的工作, 需要在溫度控制儀器中進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)獲得, 且實(shí)驗(yàn)次數(shù)的增加必然會(huì)增加實(shí)驗(yàn)誤差, 降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為減少實(shí)驗(yàn)次數(shù), 縮短實(shí)驗(yàn)周期, 本研究以兩株分離自?？诮逗Ｓ虻男∏蛟?Chlorellaspp.)為材料, 采用黃金分割優(yōu)選法對(duì)其最適生長(zhǎng)溫度進(jìn)行優(yōu)化, 以期提高微藻培養(yǎng)溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的效率。

黃金分割法優(yōu)選法又稱0.618優(yōu)選法, 是一種較簡(jiǎn)單的優(yōu)選方法, 首先由數(shù)學(xué)家華羅庚等在20世紀(jì)70年代初在釀酒等生產(chǎn)單位開始推廣并大量應(yīng)用。其基本思想是: 以區(qū)間的0.618處作為探測(cè)點(diǎn), 通過取探測(cè)點(diǎn)和探測(cè)點(diǎn)上函數(shù)值的比較, 使包含極值點(diǎn)的搜索區(qū)間不斷縮短至任意小[5]。本研究結(jié)果表明, 利用黃金優(yōu)選法, 通過3～4個(gè)溫度點(diǎn)實(shí)驗(yàn)即可找出小球藻的最佳生長(zhǎng)溫度范圍, 是微藻培養(yǎng)條件優(yōu)化的一種較簡(jiǎn)易、有效的方法。

1 材料與方法

1.1 溫度優(yōu)選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先根據(jù)小球藻的生物學(xué)特性, 以15～40℃作為小球藻溫度優(yōu)選的試驗(yàn)范圍。溫度優(yōu)選試驗(yàn)分為幾次進(jìn)行。第1次實(shí)驗(yàn): 以15～40℃范圍的0.618處, 即30.5℃作為第1個(gè)溫度試驗(yàn)點(diǎn), 將其對(duì)稱點(diǎn)24.5℃作為第2個(gè)溫度試驗(yàn)點(diǎn), 比較小球藻在這兩個(gè)溫度點(diǎn)的生長(zhǎng)狀況, 去掉“劣”點(diǎn)溫度一端部分。第2次實(shí)驗(yàn): 取已試驗(yàn)點(diǎn)(“優(yōu)”點(diǎn))的對(duì)稱點(diǎn)作為第3次試驗(yàn)點(diǎn), 在第3次試驗(yàn)點(diǎn)處試驗(yàn), 將其結(jié)果與第1次試驗(yàn)留下的“優(yōu)”點(diǎn)處試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較, 再去掉“劣”點(diǎn), 留下“優(yōu)”點(diǎn)。第3次實(shí)驗(yàn): 確定在留下部分中該“優(yōu)”點(diǎn)的對(duì)稱點(diǎn)為第4次試驗(yàn)點(diǎn), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與第2次實(shí)驗(yàn)的“優(yōu)”點(diǎn)結(jié)果比較, 再去 “劣”留 “優(yōu)”。如此, 每次實(shí)驗(yàn)可以去掉試驗(yàn)范圍的38.2%, 經(jīng)過多次試驗(yàn), 逐步縮小試驗(yàn)范圍, 直至取得滿意的結(jié)果。

1.2 藻種與培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)藻種小球藻HNC11(Chlorellasp.HNC11)分離自海南大學(xué)丘海湖, 小球藻 HNC2(Chlorellasp.HNC2)分離自?？谑邪咨抽T公園。采用不加Si的f／2培養(yǎng)基[6], 單藻種靜止培養(yǎng)。海水取自?？谑邪咨抽T海水浴場(chǎng), 經(jīng)過濾后高壓滅菌。培養(yǎng)基pH8.1, 鹽度35。

取指數(shù)生長(zhǎng)期的藻種按1:5比例接種于5 L玻璃三角瓶中。搖勻后分裝于250 mL三角瓶中, 每瓶200 mL藻液。每個(gè)處理(溫度實(shí)驗(yàn)點(diǎn))4次重復(fù)。所有實(shí)驗(yàn)處理培養(yǎng)光強(qiáng)為100 μmol/(m2·s), 光暗周期為12h:12 h, 起始細(xì)胞密度為3 × 106個(gè)/mL。

1.3 分析方法

1.3.1 生長(zhǎng)分析

培養(yǎng)液中小球藻的細(xì)胞密度與其在500 nm處的光密度值線性相關(guān)[7]。用可見分光光度計(jì)(B722s上海棱光技術(shù)有限公司)測(cè)定小球藻活體藻液的A500值, 據(jù)公式(1)換算成細(xì)胞密度。

式中,y為每mL藻液細(xì)胞數(shù);x為500 nm 處的光密度值。

據(jù)公式(2)計(jì)算指數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻在1～8 d的相對(duì)生長(zhǎng)速率。

式中,K為相對(duì)生長(zhǎng)速率;t1、t2為對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間;N1和N2分別為t1、t2時(shí)期的細(xì)胞密度;T為細(xì)胞的平均倍增時(shí)間。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)4次平行試驗(yàn)結(jié)果, 用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[8], Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)各處理間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻HNC11(Chlorella sp.HNC11)溫度優(yōu)選實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 小球藻HNC11在15℃和40℃條件下均可生長(zhǎng)。靜止培養(yǎng)條件下, 相對(duì)生長(zhǎng)速率分別為0.11 d-1和0.14 d-1, 細(xì)胞倍增時(shí)間分別為6.38 d和4.85 d。因而, 以15～40℃作為溫度優(yōu)選實(shí)驗(yàn)范圍。15～40℃范圍的黃金分割點(diǎn)為30.5℃, 其對(duì)稱點(diǎn)為24.5℃, 因此, 首先以30.5℃和24.5℃作為第1次實(shí)驗(yàn)的第1個(gè)和第2個(gè)溫度實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(圖1a), 比較小球藻在兩個(gè)溫度條件下的相對(duì)生長(zhǎng)速率。結(jié)果表明, 小球藻HNC11在30.5℃條件下的相對(duì)生長(zhǎng)速率顯著高于在24.5℃條件下的相對(duì)生長(zhǎng)速率(P＜0.05,表1)。因此, 30.5℃為“優(yōu)”點(diǎn), 24.5℃為“劣”點(diǎn), 去掉“劣”點(diǎn)一端部分, 則留下部分的溫度區(qū)間為24.5～40℃(圖1b)。

以30.5℃在24.5～40℃區(qū)間的對(duì)稱點(diǎn)34℃作為第3個(gè)溫度實(shí)驗(yàn)點(diǎn), 進(jìn)行第2次試驗(yàn)(圖1b), 比較小球藻HNC11在34℃與30.5℃條件下的相對(duì)生長(zhǎng)速率。為減小不同批次實(shí)驗(yàn)中因藻種生長(zhǎng)狀態(tài)等非處理因素引起的實(shí)驗(yàn)誤差, 在第2次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)進(jìn)行了34℃與30.5℃兩個(gè)處理。結(jié)果表明, 34℃條件下小球藻HNC11的相對(duì)生長(zhǎng)速率和平均倍增時(shí)間顯著優(yōu)于(P＜0.05)在30.5℃條件下的(表1), 因此34℃為這個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)間的“優(yōu)”點(diǎn)。去掉“劣點(diǎn)”30.5℃一端, 則可以確定第3次實(shí)驗(yàn)的溫度區(qū)間為 30.5～40℃(圖1c)。小球藻在第1和第2次實(shí)驗(yàn)中的3 0.5℃溫度點(diǎn)條件下的相對(duì)生長(zhǎng)速率無顯著差異(P＞0.05, 表1)。

第3次實(shí)驗(yàn)(圖1c): 第2次實(shí)驗(yàn)的“優(yōu)”點(diǎn)“34℃”在30.5～40℃溫度區(qū)間的對(duì)稱點(diǎn)為36.5℃。因而, 以36.5℃為第4個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn), 比較小球藻HNC11在34℃和36.5℃條件下的生長(zhǎng)速率。結(jié)果表明, 小球藻HNC11在兩個(gè)溫度條件下的相對(duì)生長(zhǎng)速率和平均倍增時(shí)間無顯著差異(P＞0.05,表1)。因而可以確定其最適生長(zhǎng)溫度為34～36.5℃。第2次和第3次實(shí)驗(yàn)中34℃溫度點(diǎn)的小球藻的相對(duì)生長(zhǎng)速率無顯著差異(P＞0.05, 表1)。

圖1 黃金分割優(yōu)選法的溫度實(shí)驗(yàn)點(diǎn) Fig. 1 Temperatures selected with golden section method

2.2 小球藻HNC2(Chlorella sp.HNC2)溫度優(yōu)選實(shí)驗(yàn)

靜止培養(yǎng)條件下, 小球藻HNC2在15℃和40℃條件下的相對(duì)生長(zhǎng)速率分別為0.16 d-1和0.14d-1, 細(xì)胞倍增時(shí)間分別為4.3 d和4.9 d。

第1次實(shí)驗(yàn)(圖1a): 以15～40℃溫度范圍的黃金分割點(diǎn)30.5℃為第1個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn), 以其對(duì)稱點(diǎn)24.5℃為第2個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn), 比較小球藻HNC2在這兩個(gè)溫度條件下的生長(zhǎng)速率。結(jié)果表明, 小球藻HNC2在30.5℃下的相對(duì)生長(zhǎng)速率顯著高于(P＜0.05)在24.5℃下的相對(duì)生長(zhǎng)速率(表1)。因此, 30.5℃為“優(yōu)”點(diǎn), 24.5℃為“劣”點(diǎn), 去掉“劣”點(diǎn)一端部分, 則留下部分的溫度區(qū)間為24.5～40℃(圖1b)。

第2次實(shí)驗(yàn)(圖1b): 以30.5℃在24.5～40℃區(qū)間的對(duì)稱點(diǎn)34℃作為第3個(gè)溫度實(shí)驗(yàn)點(diǎn), 比較30.5℃與34℃條件下的相對(duì)生長(zhǎng)率。結(jié)果表明, 34℃條件下, 小球藻HNC2的相對(duì)生長(zhǎng)速率顯著低于(P＜0.05) 30.5℃條件下的相對(duì)生長(zhǎng)速率(表1), 34℃條件下與24.5℃條件下的相對(duì)生長(zhǎng)速率無顯著差異(P＞0.05)。因此, 30.5℃為“優(yōu)”點(diǎn), 34℃為“劣”點(diǎn), 去掉“劣”點(diǎn)一端部分, 則留下部分的溫度區(qū)間為24.5～34℃(圖1d)。

第3次實(shí)驗(yàn)(圖1d): 以30.5℃在24.5～34℃區(qū)間的對(duì)稱點(diǎn)28℃作為第3個(gè)溫度實(shí)驗(yàn)點(diǎn), 進(jìn)行第2次試驗(yàn)。結(jié)果表明, 30℃條件下, 小球藻HNC2的相對(duì)生長(zhǎng)速率與28℃條件下的相對(duì)生長(zhǎng)速率無顯著差異(P＞0.05)。由此推斷, 小球藻HNC2的最適生長(zhǎng)溫度為28～30.5℃。

表1 不同溫度條件下小球藻HNC11和HNC2的相對(duì)生長(zhǎng)速率和平均倍增時(shí)間 Tab. 1 Relative growth rate and average generation time of Chlorella sp. HNC11 and Chlorella.sp. HNC2 under different temperature conditions

3 討論

我國(guó)著名數(shù)學(xué)家華羅庚先生從1964年起, 在全國(guó)推廣優(yōu)選法, 利用“0.618優(yōu)選法”解決了生產(chǎn)實(shí)踐中的許多問題[9]。在單因素優(yōu)選問題中, 黃金分割優(yōu)選法在選擇配比方法、操作工藝及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面都起到了重要作用, 不僅減少了試驗(yàn)成本, 降低了消耗, 而且提高了質(zhì)量和產(chǎn)量[10-12]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 應(yīng)用黃金分割優(yōu)選法, 可以用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)快速地找到小球藻的最適培養(yǎng)溫度。

在溫度優(yōu)選實(shí)驗(yàn)中, 為減少誤差, 每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)做兩個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn), 如HNC11的30.5℃實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在第1次和第2次實(shí)驗(yàn)中各做了1次。而我們的結(jié)果表明, 當(dāng)藻種的接種密度、培養(yǎng)基和生態(tài)因子等培養(yǎng)條件一致時(shí), 小球藻在不同批次的實(shí)驗(yàn)中, 同一溫度下的相對(duì)生長(zhǎng)速率無顯著差異(P＞0.05)。因此在利用黃金優(yōu)選法時(shí), 在控制藻種的接種密度、培養(yǎng)基及生態(tài)因子等培養(yǎng)條件一致性的情況下, 每個(gè)溫度點(diǎn)僅做一次實(shí)驗(yàn)即可, 試驗(yàn)數(shù)將比本次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)減少。如小球藻HNC11在第2次實(shí)驗(yàn)中, 只測(cè)定34℃條件下的相對(duì)生長(zhǎng)率即可, 然后與第1次實(shí)驗(yàn)的“優(yōu)”點(diǎn)(30.5℃)結(jié)果比較即可。因而, 將黃金分割優(yōu)選法應(yīng)用在微藻最適培養(yǎng)溫度條件的選擇上, 將顯著地減少實(shí)驗(yàn)次數(shù), 提高優(yōu)化效率。

小球藻是綠藻門小球藻科中的一個(gè)重要屬, 其環(huán)境適應(yīng)強(qiáng), 分布較廣, 生長(zhǎng)快, 易大量培養(yǎng), 在特定條件下可積累大量油脂[13-14], 因而不但是重要的餌料藻, 也是生產(chǎn)蛋白、色素及制備生物柴油的良好藻種。篩選適應(yīng)不同生長(zhǎng)環(huán)境的藻種有利于微藻的開發(fā)和利用。溫度優(yōu)選法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在?？诮逗Ｓ蚍蛛x的小球藻株喜溫耐熱, 適宜在熱帶和亞熱帶地區(qū)培養(yǎng)。

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