樊 迎，王常青 ，王 菲，于書佳，連偉帥，原 敏

山西大學生命科學學院，太原030006

黑豆(Glycine soja Sieb.et Zucc )屬于種皮為黑色的大豆，根據顆粒大小可分為大黑豆和小黑豆兩種，我國年產量約為200 萬噸，主產于山西、陜西與河北等省區(qū)［1］?？茖W研究證實黑豆中含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素和粗纖維，其中蛋白質含量比一般大豆高8%～10%，達48% 以上，居豆類之首［2］。其必需氨基酸構成比例合理，是一種完全蛋白質。本實驗室前期研究得知，在小黑豆分離蛋白加工所得的乳清廢水中，乳清蛋白的含量占總質量的2.9%(高于大豆的2.6%)，且具抗氧化等保健作用。

皮膚衰老是內在生理因素和外部環(huán)境因素共同作用的結果，長期紫外線照射是造成皮膚衰老的重要原因之一［3］。近20 年來，隨著全球臭氧層的破壞，過量紫外線照射對人體的危害日漸突出，如曬傷、曬黑、皮膚老化甚至皮膚癌等，且報道有逐年上升的趨勢［4］，使用防曬類藥物或護膚品的消費者越來越多。同時，天然抗光老化物質和化妝品也越來越多受到人們的關注。本試驗以紫外線照射誘導皮膚光老化的小鼠為模型，研究黑豆乳清多肽(Black Bean Whey Peptides，BBWP)對皮膚光老化的保護作用，為黑豆乳清的深度開發(fā)奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

研究所用BBWP 由本實驗室采用酸性蛋白酶水解黑豆乳清得到;經檢測，該干燥物中多肽含量為45.6%，其中分子量在3000 Da 以下的多肽占總肽的85%;試驗所用的昆明種雌性小鼠(SPF 級，體重22～25 g)7 周齡，由山西醫(yī)科大學動物中心提供;脫毛膏(市售);羥脯氨酸(HYP)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所;其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

UVA(波長320～420 nm)、UVB(波長280～320 nm)紫外燈管(南京華強電子有限公司);皮膚光電檢測儀(廣州利佰格儀器設備廠);MR1822 高速冷凍離心機(法國Jouan 公司);Lecia RM2255 輪轉式切片機(德國leica 儀器公司);體視顯微鏡(上海光學儀器廠);顯微電子攝像機(杭州科藝科技公司);Spectramax M5 多功能酶標儀(天津泰科嘉華金屬貿易有限公司);Olympus BX51 顯微照相儀(日本奧林巴斯公司);其他儀器均為常規(guī)。

2 試驗方法

2.1 試驗動物飼養(yǎng)及分組

試驗小鼠經適應性喂養(yǎng)后，隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組(Vc 組)、基質組、給藥大、小劑量組6 組，每組10 只。全部喂食基礎飼料［5］。試驗持續(xù)12 周，期間，每只小鼠日投食量為5 g，自由飲水。

2.2 模型建立與試驗給藥方法

各組小鼠背部脫毛，使其暴露面積為2 cm × 3 cm。于脫毛的第二日開始涂抹不同濃度的受試物(見表1)，每日涂抹一次，每次每只的劑量為0. 1 mL。從脫毛的第二周開始，除空白組外的其他各組均用80 W 的UVA 燈管和160 W 的UVB 燈管在距小鼠約40 cm 的上方進行紫外照射，照射時間以出現皮膚輕度泛紅為準。每天照射一次，持續(xù)12 周，累計照射劑量約為UVA304. 5 J/cm2、UVB6. 3 J/cm2［6］。定期脫毛并觀察小鼠背部皮膚的變化，每周稱重并檢測皮膚表面損傷程度。

表1 各組乳液配方Table 1 Sample preparation

2.3 皮膚取材及其生化指標測定方法

最后一次紫外照射后24 h，頸椎脫臼處死小鼠，剪取脫毛區(qū)受試部位的皮膚，用生理鹽水漂洗，去除粘連的皮下組織，濾紙拭干后用直徑為0.8 cm 的打孔器鉆取面積相等的4 片皮膚，稱重后，取兩片放入中性甲醛液固定，其余皮膚放入液氮中研磨成粉末。隨后稱取一定質量研磨后的皮膚粉末加入10 倍冷生理鹽水震蕩均勻。于4 ℃、5000 rpm 下離心10 min。取上清液，用Folin-酚法測定皮膚蛋白含量［7］，遵循試劑盒說明測定HYP、MDA 含量和CAT活性。

2.4 皮膚形態(tài)學和組織學觀察與分析

每周用皮膚檢測儀觀察小鼠背部皮膚形態(tài)變化，并截取圖片。試驗皮膚以10%中性緩沖福爾馬林液固定后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，H. E.染色，光鏡下觀察皮膚結構。

2.5 統(tǒng)計分析

3 試驗結果與結論

3.1 各組小鼠相同面積皮膚質量

皮膚的松弛、增厚、粗糙是光老化皮膚的共性。由表2 數據可以看出，在皮膚取樣面積相同的前提下，與模型組相比，基質組與模型組處于同一水平，說明基質乳液沒有抗光老化的作用;除基質組組外的皮膚質量都顯著增高(P ＜0.01)，其中，黑豆乳清多肽大劑量組的數據最接近基礎組。這表明黑豆乳清多肽能減緩光老化引起的皮膚增厚，其效果與Vc 效果相近，具有抗光老化、延緩衰老的作用。

表2 各組小鼠相同面積皮膚質量分析(±s，n=10)Table 2 Same area skin weight of experimental mice in different groups(±s，n=10)

表2 各組小鼠相同面積皮膚質量分析(±s，n=10)Table 2 Same area skin weight of experimental mice in different groups(±s，n=10)

注:* 表示與模型組比較差異顯著，P ＜0.05;＊＊表示與模型組比較差異極顯著，P ＜0.01。Note:Compare with model group，* P ＜0.05;＊＊ P ＜0.01.

組別Group涂抹劑量及種類Daub dose and types周數Week皮膚質量Skin mass(mg)空白組Normal 蒸餾水Distillated water 12 239.9 ±35.0＊＊模型組Model 蒸餾水Distillated water 12 290.6 ±41.2基質組Base material 基質乳液Base material emulsion 12 294.5 ±31.1陽性對照組Vc 10%Vc 乳液10%Vc emulsion 12 247.4 ±14.5＊＊多肽大劑量組BBWP-H 15%多肽乳液15%Peptide emulsion 12 241.5 ±30.6＊＊多肽小劑量組BBWP-L 5%多肽乳液5%Peptide emulsion 12 243.3 ±29.8＊＊

表3 BBWP 對光老化小鼠皮膚CAT、HYP、MDA 的影響(±s，n=10)Table 3 Effects of BBWP on CAT，HYP，MDA of anti-aging mouse skin(±s，n=10)

表3 BBWP 對光老化小鼠皮膚CAT、HYP、MDA 的影響(±s，n=10)Table 3 Effects of BBWP on CAT，HYP，MDA of anti-aging mouse skin(±s，n=10)

注:* 表示與模型組比較差異顯著，P ＜0.05;＊＊表示與模型組比較差異極顯著，P ＜0.01。Note:Compare with model group，* P ＜0.05;＊＊ P ＜0.01.

組別Group數量Quantity CAT 活力水平Activity index(U/gHb)羥脯氨酸含量HYP Content(ug/mg wet weight)丙二醛含量MDA Content(nmol/mg prot)空白組Normal 10 90.640 ±28.471＊＊ 0.347 ±0.139＊＊ 2.359 ±0.681＊＊模型組Model 10 29.532 ±11.083 0.225 ±0.085 4.568 ±1.792基質組Base material 10 46.521 ±15.789 0.236 ±0.065 3.937 ±0.467*陽性對照組Vc 10 94.776 ±21.014＊＊ 0.301 ±0.104＊＊ 2.789 ±1.041＊＊多肽大劑量組BBWP-H 10 166.044 ±42.441＊＊ 0.278 ±0.045* 2.907 ±0.845＊＊多肽小劑量組BBWP-L 10 103.053 ±34.042＊＊ 0.240 ±0.053 3.191 ±1.390＊＊

3.2 各組小鼠皮膚組織中CAT 活力水平與HYP、MDA 含量測定結果

由表3 可知，與模型組相比，空白組小鼠皮膚的CAT 活力水平與HYP 含量顯著升高(P ＜0.01)，MDA 含量顯著降低(P ＜0.01)，說明皮膚光老化建模成功。過氧化氫酶(CAT)存在于動物的各個組織和皮膚中，其活力水平的高低反映了體內清除過氧化產物及自由基能力的強弱。表3 中的數據表明了黑豆乳清多肽能極顯著提高小鼠皮膚中CAT 活力水平(P ＜0.01)，且其提高能力遠大于10%的Vc;羥脯氨酸(HYP)是膠原蛋白特有的氨基酸之一，其含量可以間接反映出膠原蛋白含量。而膠原蛋白會隨著年齡的增長逐漸流失，其含量變化可反映皮膚的衰老程度，故HYP 可作為判定皮膚衰老程度的一個特殊指標［8］。與模型組比較，陽性對照組的HYP 含量顯著上升(P ＜0.01)，BBWP 大劑量組也明顯上升(P ＜0.05)，BBWP 小劑量組雖有上升，但無統(tǒng)計學差異，說明黑豆乳清多肽能提高膠原蛋白的含量，且呈現一定的量效關系;丙二醛(MDA)含量可以反映機體組織的過氧化或老化程度［9］。表3 數據表明，BBWP 大小劑量組均能顯著降低小鼠皮膚中MDA 含量(P ＜0.01)，其效果與10%的Vc 等同。而基質組與模型組相比，除了能顯著提高MDA 含量(P ＜0.05)外，對其余指標的影響均無統(tǒng)計學意義，說明基質乳液是不能抗光老化的。以上數據綜合提示:黑豆乳清多肽能提高抗氧化體系的酶活力水平，減緩膠原蛋白的流失，清除脂質過氧化物、延緩皮膚衰老，具有抗皮膚光老化的作用。

3.3 黑豆乳清多肽對小鼠皮膚形態(tài)學影響

3.3.1 小鼠皮膚表面觀察

肉眼觀察(圖1)可見空白組小鼠脫毛區(qū)皮膚表面光滑、無皺紋、色澤紅潤，沒有皺紋和色素斑;模型組小鼠的皮膚光老化區(qū)變厚變硬、脫屑、出現深大的皺紋和溝壑，有色素沉著;陽性對照組的皮膚狀況接近于基礎組，但紅色的毛細血管比基礎組明顯，有少量紅斑;基質組的皮膚接近于模型組，但與之不同的是粗大的皮膚溝紋較少，皮膚顏色偏紅;黑豆乳清多肽大、小劑量組情況較陽性對照組稍差，但也基本接近于基礎組，其中以大劑量組效果更佳，說明黑豆乳清多肽能顯著改善光老化引起的皮膚變硬、色澤灰暗、彈性差的癥狀，具有抗光老化的作用。

圖1 各組小鼠皮膚表面觀察Fig.1 Eye observe of mice skin in different groups with the effert of BBWP

3.3.2 皮膚光電檢測儀分析

用皮膚光電檢測儀攝像觀察發(fā)現(圖2)，空白組小鼠皮膚紋理清楚，表面光滑無皺紋，纖維無卷曲無扭結，排列有序，無斷裂現象;而模型組小鼠的脫毛區(qū)皮膚深暗、粗糙并有明顯紅斑，有深褶皺，彈性纖維發(fā)生變性，呈無定形的顆粒狀，局部真皮乳頭層和網狀層出現斷裂，同時又出現大量異常增生的粗短的彈力纖維，大多卷曲、分叉、彼此纏繞無規(guī)則［10］;基質組情況接近于模型組;陽性對照組除局部有紅斑之外其余與基礎組相同;黑豆乳清多肽的大、小劑量組介于陽性組合基質組之間，其中大劑量組皮膚表面比較光滑，彈性纖維排列有序，損傷程度低于小劑量組?？梢姡磕?5%的黑豆乳清多肽可以減少光老化引起的真皮層中彈性纖維的變性，對光老化有一定的保護作用。

圖2 各組小鼠皮膚光電檢測儀觀察(×100)Fig.2 Photoelectric detector observe of mice skin in different groups with the effert of BBWP

圖3 各組小鼠皮膚組織學變化(H.E. ×400)Fig.3 Histological change of mice skin in different groups with the effert of BBWP

3.3.3 小鼠皮膚H.E.染色觀察

在光鏡下觀察細胞形態(tài)(圖3)，發(fā)現模型組動物的表皮有明顯的厚度不均一;真皮層增生明顯，微毛細血管擴張并扭曲，皮脂腺不規(guī)則增生;纖維分布疏松，局部出現不規(guī)則分布，有斷裂現象，成纖維細胞形態(tài)變形;外形不規(guī)則，有變異的細胞器，說明本試驗成功建立了光老化模型?？瞻捉M動物皮膚纖維分布整齊，有規(guī)則，無斷裂現象，成纖維細胞外形清晰，說明細胞的蛋白質合成功能旺盛。基質組較基礎組相比，也出現典型的光老化病理變化:表皮厚度不均一，有脫落，真皮層變厚明顯，炎性細胞浸潤多見，皮脂腺不規(guī)則增生。陽性對照組和黑豆乳清多肽大、小劑量組的皮膚損傷程度大大減輕，膠原纖維排列整齊緊密，膠原纖維密度顯著增加，纖維斷裂、排列紊亂和聚集成團等現象也得到改善。這表明Vc 和乳清多肽可能刺激了膠原纖維的新生和重排，可有效減輕和逆轉UVA 和UVB 所致的皮膚光老化，使其恢復至接近正常皮膚的水平(見圖3)。

4 討論

皮膚老化是由多種因素引起的，其中紫外線引起的皮膚光老化在近幾年尤為顯著。本試驗研究了黑豆乳清多肽對小鼠皮膚光老化的保護作用，結果表明:每日在小鼠背部脫毛區(qū)2cm ×3cm 的皮膚上涂抹15%的黑豆乳清多肽15 mg，可以明顯降低皮膚組織中的MDA 含量和提高HYP 含量，效果與10%的Vc 處于同一水平;但該劑量對CAT 活力的提高優(yōu)于Vc，體現了較好的抗氧化作用。原因可能為黑豆乳清小分子多肽具有較強的清除自由基的能力，或者是對紫外線有一定的吸收作用，詳盡的機制還有待進一步研究。

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