王學(xué)志，李文蘭，2* ，白 晶，2，郎 朗，2

1 哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心;2國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076

中藥穿心蓮(Andrographis)系爵床科穿心蓮屬植物，具有清熱抗炎、抗感染、抗心血管疾病、抗生育、抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等多種藥理作用［1-5］。研究結(jié)果表明:穿心蓮對(duì)雄性大鼠精子的形成有顯著影響，雌鼠不易受孕［6，7］，具有一定的生殖毒性。為從體內(nèi)過(guò)程追蹤其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，分析口服給藥后能進(jìn)入血液的成分，尋找成分間的相互作用規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化血清樣品的處理方法，以期減少血清中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，獲取更多的入血成分信息，并在此基礎(chǔ)上在確定最佳的取血時(shí)間和血清處理方法，為下一步體內(nèi)入血成分的分析提供依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters 高效液相(HPLC)系統(tǒng)(W2695 泵、W2996DAD 檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower 化學(xué)工作站);恒溫水浴(DK80，上海一恒科技有限公司);分析天平(ALC-110.4，上海人和科學(xué)儀器有限公司);臺(tái)式低溫離心機(jī)(Avanti 30，美國(guó)BECKMAN);電熱恒溫水浴鍋(DK-80，上海一恒科技有限公司);超聲震蕩儀(H66MC，美國(guó)奧好斯科技有限公司);XW-80A 型快速蝸旋器。穿心蓮［Andrographis paniculata (Burm.f.)Nees.］(哈爾濱市圣泰中藥飲片加工廠(chǎng)，批號(hào):080501)。乙腈、甲醇(色譜純，山東禹王);甲酸(色譜純，上海科銳);自制超純凈水、高氯酸(天津市東方化工廠(chǎng))。Wistar 雄性大鼠(由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)，體重180～240 g，批號(hào)SCXK-(黑)2006-2010。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 穿心蓮體外藥材樣品制備

精密稱(chēng)取100 g 穿心蓮全葉藥材，先用3 倍量的95%的乙醇溫浸2 h，回流提取3 次，第一次用10倍量提取1.5 h、后兩次用7 倍量分提取1 h，合并續(xù)濾液55 ℃左右減壓回收乙醇濃縮至1/3 體積［7］。

2.2 色譜條件考察

色譜柱:Waters Symmetry ShieldTMRP18 (3. 9 mm × 150 mm，5 μm);保 護(hù)柱:Nova-Pak C18 Guard-PakTM;進(jìn)樣量:20 μL;流動(dòng)相:乙腈-0.2%甲酸水溶液洗脫系統(tǒng);流速:0.8 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):200～400 nm 全波長(zhǎng)掃描，篩選最佳的檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相梯度變化程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度變化程序表Table 1 Gradient elution program of mobile phases

2.3 空白及含藥血清的制備

取Wistar 大鼠4 只，稱(chēng)重，依據(jù)8 g/100 g［7］劑量灌胃，分別給予蒸餾水和灌胃藥液，每次間隔12 h，連續(xù)給藥3 d，于末次給藥后用10%水合氯醛麻醉，取血5 mL，置于一次性5 mL 采血管內(nèi)，室溫放置30 min，待其凝血后，待血凝塊收縮血清充分析出后，以3000 rpm 離心10 min，取上清液2 mL 即得空白和含藥血清。

2.4 血清樣品處理方法考察

針對(duì)血清中化學(xué)成分的復(fù)雜性，以及血中內(nèi)源性成分的干擾，本實(shí)驗(yàn)取Wistar 大鼠4 只，禁食12 h(自由飲水)，稱(chēng)重，按照8 g/100 g，灌胃給予“2.1”項(xiàng)下所制藥液后60 min，用10%水合氯醛麻醉，經(jīng)肝門(mén)靜脈取血5 mL，全血靜置凝結(jié)后，置于37 ℃水浴中30 min 取出。然后采取以下3 種方法對(duì)血清進(jìn)行預(yù)處理。

2.4.1 高氯酸法 精密吸取0.2 mL 含藥血清，加入0.04 mL 0.6%高氯酸，快速混勻10 min，加入重蒸水至1.2 mL，渦旋混勻10 min，15000 rpm 離心20 min，取上清液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜為含藥血清供試品。同法操作制得空白血清供試品。

2.4.2 甲醇法 精密吸取0.2 mL 含藥血清，加入甲醇至1.2 mL，渦旋混勻10 min，15000 rpm 離心20 min，取上清液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜為含藥血清供試品。同法操作制得空白血清供試品。

2.4.3 乙酸乙酯法 精密吸取0.2 mL 含藥血清，加2 倍量乙酸乙酯萃取，然后以3000 rpm 離心5 min，吸取上清液，水相再加入4 倍量的甲醇，渦旋2 min，然后以3000 rpm 離心5 min，合并上清液，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜為含藥血清供試品。同法操作制得空白血清供試品。

由于不同的血清處理方法表現(xiàn)出不同的HPLC圖譜，為了盡可能地表現(xiàn)含藥血清的真實(shí)面貌，應(yīng)對(duì)含藥血清采取盡量少的處理步驟，以減少處理過(guò)程對(duì)血清化學(xué)成分產(chǎn)生的影響。根據(jù)以上3 個(gè)方法，篩選出處理步驟最少且雜質(zhì)峰較少、峰形較好的血清處理方法。

2.5 最佳取血時(shí)間考察

取Wistar 大鼠4 只，禁食12 h(自由飲水)，稱(chēng)重，按照8 g/100 g，灌胃給予所制藥液后0.5 h，1 h、1.5 h、2 h，用10%水合氯醛麻醉，經(jīng)肝門(mén)靜脈取血5 mL，全血靜置凝結(jié)后，置于37 ℃水浴中30 min 取出，甲醇法處理含藥血清以供HPLC 分析。取制好的空白血清樣品及給藥組血清樣品各25 μL，進(jìn)行HPLC 分析，確定最佳的采血時(shí)間。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 血清樣品處理方法確定

圖1 不同血清處理方法HPLC 色譜圖比較Fig.1 Comparison of HPLC chromatograms of different serum processing methods

如圖1，高氯酸法和乙酸乙酯法制得的血清樣品，引入血中固有雜質(zhì)較少，但是能夠檢測(cè)的入血成分少，富集能力差，且高氯酸具有強(qiáng)氧化性，給體內(nèi)成分分析帶來(lái)干擾，不適合于本研究。甲醇法此方法制得的血清樣品，被檢測(cè)出的入血成分峰較多，分離效果好，富集程度較高，因此確定甲醇法作為本研究的血清樣品制備方法。

3.2 最佳取血時(shí)間確定

如圖2，結(jié)果表明，給藥后1 h 后的血清樣品中，穿心蓮的入血成分多，峰型好，而且濃度高，最適于分析。因此，選定1 h 為最佳取血時(shí)間。

圖2 不同取血時(shí)間HPLC 色譜圖比較Fig.2 Comparison of HPLC chromatograms of different blood sampling time

3.3 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器，在分析時(shí)進(jìn)行全波長(zhǎng)紫外掃描(200～400 nm)，并對(duì)同一樣品提取不同波長(zhǎng)下的色譜圖，如圖3，經(jīng)比較結(jié)果表明，在275 nm 波長(zhǎng)下色譜圖峰形最好，出峰數(shù)目適中，各色譜峰相互之間分離度較好(254 nm 下55 min處峰雖高但峰形不好，對(duì)下一步質(zhì)譜分析幫助不大)，故檢測(cè)波長(zhǎng)定為275 nm。

圖3 不同波長(zhǎng)下HPLC 色譜圖比較Fig.3 HPLC chromatograms of samples with different detection wavelengths

3.4 體內(nèi)血清指紋圖譜建立

如圖4，分別吸取體外藥材樣品、含藥血清、空白血清供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄70 min 色譜圖。共在血清樣品中發(fā)現(xiàn)是10 個(gè)成分，通過(guò)對(duì)比逐個(gè)峰的色譜圖與光譜圖，結(jié)果顯示，1、4、8、9 號(hào)峰為原型成分，2、3、5、6、7、10 號(hào)峰推測(cè)其為體內(nèi)代謝產(chǎn)物。

圖4 體外藥材樣品、給藥血樣、空白血樣HPLC 色譜圖比較Fig.4 Comparison of HPLC chromatograms of sample directly extracted by rat serum，sample with oral administration of drug and blank rat serum

4 結(jié)論

目前對(duì)穿心蓮的藥效作用研究比較廣泛，但研究大多限于其解熱、抗菌、抗炎等藥理學(xué)作用。關(guān)于穿心蓮的生殖毒性及其物質(zhì)基礎(chǔ)，至今尚未見(jiàn)翔實(shí)的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)確定了在前期實(shí)驗(yàn)［7］已確定有生殖毒性的劑量下給藥后1 h，肝門(mén)靜脈取血后采用甲醇處理的方法，來(lái)建立穿心蓮血清指紋圖譜，并對(duì)穿心蓮體內(nèi)成分加以分析，得出10 個(gè)成分中，有4 個(gè)為原型成分，6 個(gè)推測(cè)其為穿心蓮體內(nèi)代謝產(chǎn)物，為下一步利用質(zhì)譜技術(shù)分析其成分，代謝途徑及其結(jié)構(gòu)演變提供支持，從而為優(yōu)化穿心蓮臨床使用的正確的用法、用量，增強(qiáng)用藥的安全性以及為把穿心蓮開(kāi)發(fā)為一種避孕藥提供參考依據(jù)。

1 He QE(何恩其)，Zhao F(趙烽).Study progress and pharmacological action of andrographitis.Guid J Tradit Chin Med(中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào))，2007，13:107-108.

2 Akowuah GA，Zhari I，Mariam A. Analysis of urinary andrographolides and antioxidant status after oral administration of andrographis paniculata leaf extract in rats. Food Chem Toxicol，2008，46:3616-3617.

3 Bhan MK，Dhar AK，Khan S，et al. Screening and optimization of andrographis paniculata(Bunn.f.)Nees for total andrographolide content，yield and its components. Scientia Horticulturae，2006，107:386-391.

4 Yan J，Chen Y，He C，et al.Andrographolide induces cell cycle arrest and apoptosis in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.Cell Biol Toxicol，2012，28:47-56.

5 Dai GF(戴桂馥)，Wang JF(王俊峰)，He SW(何帥偉)，et al.Andrographolide derivatives and its pharmacological activity research progress. Chin Tradit Patent Med(中成藥)，2006，28:1032-1035.

6 Akbarsha MA，Kashman Y，Shukla S，et al. Aspects of the male reproductive toxicity/male anitifertility property of andrographolide in albino rats:effect on the testis and the cauda epididymidal spermatozoa.Phytother Res，2000，14:432-433.

7 Li WL(李文蘭)，Xue J(薛佳)，Wang XZ(王學(xué)志)，et al.The research on relationship between time and effects of andrographis reproductive toxicity. J Harbin Univ Commerce，Nat Sci Edi(哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2011，27:645-648.