倪婷婷，李 璐，趙 明，邵宛芳，李家華

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院，昆明650201

茶槲寄生“螃蟹腳”系桑寄生科槲寄生屬(Viscum articulatum Burm)［1］植物，是一種寄生在樹(shù)齡較老的古喬木茶樹(shù)上的寄生植物，為多年生草本，形狀像小珊瑚，因寄生枝桿節(jié)狀帶亳像螃蟹，故此被稱(chēng)為“螃蟹腳”。在世界茶樹(shù)起源中心地—云南普洱、西雙版納等地區(qū)，由于其特殊的地理位置和生態(tài)環(huán)境，古茶園的古茶樹(shù)上就寄生著“螃蟹腳”。據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》記載，槲寄生 Viscum coloratum(Kom.)Nakai 作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，以干燥的帶葉莖枝入藥，其性涼，微酸微苦、平，歸肝、腎經(jīng)，有祛風(fēng)除濕、補(bǔ)腎安胎、強(qiáng)筋壯骨等功效［2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究還表明，槲寄生具有降壓、護(hù)心(抗心率失常和改善心臟微循環(huán)、抗心肌缺氧)、抗腫瘤(有細(xì)胞毒性，歐洲傳統(tǒng)視為腫瘤藥物，在歐洲桑寄生科植物藥是晚期癌癥保守療法的主藥)等作用［3，4］。“螃蟹腳”作為槲寄生屬植物，與槲寄生 Viscum coloratum(Kom.)Nakai 具有同等功效［1］。

近年來(lái)，對(duì)槲寄生屬的研究發(fā)展較快，國(guó)內(nèi)已對(duì)寄生在柿、栗、榆、樺、柳、楓、楊等樹(shù)上的有報(bào)道和專(zhuān)利［5，6］。已有研究表明，槲寄生屬植物的主要功能成分為黃酮類(lèi)化合物、生物堿、三萜及甾醇類(lèi)和一些高分子化合物［7］。與上述植物的槲寄生屬植物相比，茶槲寄生“螃蟹腳”由于主要寄生在古茶樹(shù)上，一直以來(lái)都沒(méi)有得到人類(lèi)的認(rèn)識(shí)和利用，只是隨著古樹(shù)普洱茶熱的興起，寄生在古茶樹(shù)上的“螃蟹腳”被古茶區(qū)人民發(fā)現(xiàn)并作為飲料利用后，才逐漸被世人認(rèn)識(shí)。本文采用HPLC 法對(duì)“螃蟹腳”的多酚類(lèi)化合物中的黃酮醇及黃烷醇類(lèi)物質(zhì)的組成進(jìn)行了定性分析，并采用三氯化鋁比色法、酒石酸鐵法測(cè)定了“螃蟹腳”黃酮類(lèi)化合物和茶多酚的總含量，HPLC法定量分析了楊梅素、槲皮素和山柰酚的含量，旨在為以后對(duì)其單體成分的提取、藥理作用及分子生物學(xué)等方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“螃蟹腳”(Viscum articulatum Burm)采自云南省普洱市瀾滄拉祜族自治縣的景邁萬(wàn)畝古茶園的古茶樹(shù)上，樣品經(jīng)日光曬干后置于冰箱(-20 ℃)保存。槲皮素標(biāo)準(zhǔn)樣、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)樣(中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度分別是:96.5%和95.9%);楊梅素標(biāo)準(zhǔn)樣(Sigma-Aldrich 公司，純度≥96.0%);甲醇、乙氰為色譜純，水為超純水，磷酸為分析純，鹽酸為分析純(濃度36%～38%)，丙酮為分析純(濃度≥99.5%);兒茶素標(biāo)準(zhǔn)樣:表沒(méi)食子兒茶素(EGC，純度99.8%)，表兒茶素(EC，純度99.8%)，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG，純度98%)，表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG，純度98.9%)，標(biāo)樣購(gòu)于Dr.Ehrenstorfer 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(HPLC)分析裝置:美國(guó)Agilent 1200 型高效液相色譜系統(tǒng)(UV 檢測(cè)器:Agilent 1200VWD G1314B;柱溫箱:Agilent 1100/1200 G1316A;進(jìn)樣器:Agilent 1100/1200 溫控自動(dòng)進(jìn)樣器G1329A;脫氣機(jī):Agilent 1100/1200 G1322A;溶劑輸送泵:Agilent 1100/1200 四元泵G1311A);TSK gel ODS-80TM色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm，日本Tosoh 公司);電子天平(型號(hào):CP214，奧豪斯儀器(上海)有限公司);微型植物試樣粉碎機(jī)(型號(hào):FZ102，北京市永光明醫(yī)療儀器廠);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(型號(hào):756CRT，上海箐華科技儀器有限公司);0.45 μm 有機(jī)系微孔濾膜(天津市騰達(dá)過(guò)濾器件廠);電熱恒溫水浴鍋(上海精密儀器儀表廠);回流裝置(自制)。

1.3 方法

1.3.1 黃酮醇類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的制備

分別精密稱(chēng)取楊梅素、槲皮素和山柰酚對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.3 mg 的溶液，

作為對(duì)照品溶液。

1.3.2 黃烷醇類(lèi)物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)液的制備

分別稱(chēng)取4 種主要兒茶素標(biāo)準(zhǔn)樣5.0 mg 于50 mL 棕色容量瓶中加入50 mL 70%甲醇溶液溶解混勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)樣溶液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 黃酮醇類(lèi)物質(zhì)HPLC 分析用“螃蟹腳”樣品供試溶液的制備

植物中的黃酮類(lèi)物質(zhì)主要以水溶性的黃酮苷為主，但是黃酮苷的種類(lèi)繁多，標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量太少，不利于分析。因此需要先將其水解為苷元來(lái)測(cè)定。本文參照文獻(xiàn)［8］，用水浴加熱回流裝置制備供試品溶液。精確稱(chēng)取“螃蟹腳”粉末1.00 g，加甲醇40 mL，鹽酸分析純(濃度36%～38%)4 mL，置于圓底燒瓶中回流水解1.5 h(85 ℃)，過(guò)濾，濾液置50 mL 容量瓶，用少許甲醇洗滌殘?jiān)叭萜?，洗滌液并入容量瓶中，加甲醇定容?0 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm 有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行色譜分析。

1.3.4 黃烷醇類(lèi)物質(zhì)HPLC 分析用“螃蟹腳”樣品供試溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取“螃蟹腳”粉末1. 00 g，加入30 mL 80%丙酮溶液，室溫靜置24 h，重復(fù)3 次。合并3 次浸提液用濾紙過(guò)濾，濾液經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮除去丙酮，濃縮液中加入70%甲醇水溶液定容至50 mL，搖勻，供試液經(jīng)0.45 μm 有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行色譜分析［9］。

1.3.5 茶多酚總含量的測(cè)定

酒石酸鐵比色法(國(guó)標(biāo)GB/T8315)［10］。

1.3.6 黃酮類(lèi)化合物總含量的測(cè)定

黃酮按參考文獻(xiàn)1 的方法提取，即稱(chēng)取“螃蟹腳”樣品粉末1.00 g，在60 ℃條件下以45%乙醇為提取溶劑，固液比1:5(即加入45%乙醇5 mL)，回流提取3 次，2 h/次。3 次提取液合并至25 mL 容量瓶中，并用45%的乙醇定容至刻度，作為供試品溶液［1］。含量測(cè)定用三氯化鋁比色法［11］。

1.3.7 HPLC 分析條件

1.3.7.1 黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的HPLC 分析條件

色譜柱:TSK gel ODS-80TM色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm，日本Tosoh 公司)。流動(dòng)相:A 相:0.2%磷酸水溶液;B 相:80%甲醇。梯度從30%B到80%B，流速0.8 mL/min，55 min 內(nèi)完成，檢出波長(zhǎng)360 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，每次完成后系統(tǒng)平衡10 min 后再次進(jìn)樣［8］。

1.3.7.2 黃烷醇類(lèi)物質(zhì)的HPLC 分析條件

色譜柱:TSK gel ODS-80TM色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm，日本Tosoh 公司)。流動(dòng)相:A 相:(0. 05M H3PO4-H2O)-5% CH3CN;B 相:(0. 05M H3PO4-H2O)-80%CH3CN;梯度從9%B 到53%B，流速0.7 mL/min，55 min 內(nèi)完成，檢出波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10 μL，每次完成后系統(tǒng)平衡15 min 后再次進(jìn)樣［12］。

1.3.8 結(jié)果計(jì)算

“螃蟹腳”樣品中黃酮醇苷元含量的計(jì)算式見(jiàn)下式［8］。

式中Wa，b，c為試樣中楊梅素(a)、槲皮素(b)和山柰酚(c)檢出峰的含量，單位:mg/g;C1，2，3為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上楊梅素(1)、槲皮素(2)和山柰酚(3)檢出峰的濃度，單位:mg/mL;V 為樣品定容體積，單位:mL;M 為試料的質(zhì)量，單位:g。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC 分析方法的評(píng)價(jià)

2.1.1 精密度、準(zhǔn)確度及最低定量值

分別進(jìn)樣楊梅素、槲皮素和山柰酚系列標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 mg/mL)，按1.3.7.1 中的色譜分析條件進(jìn)樣分析。以濃度(mg/mL)為X，峰面積為Y，計(jì)算得楊梅素、槲皮素及山柰酚的回歸方程。以信噪聲比S/N =3 計(jì)算最低檢出量(LOD)和最低定量值(LOQ)。分別進(jìn)樣分析上述3種標(biāo)準(zhǔn)使用液，計(jì)算5 次分析峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。上述分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 楊梅素、槲皮素和山奈酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、檢出量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Standard curve，LOD-LOQ and RSD of myricetin，quercetin and kaempferol

2.1.2 穩(wěn)定性

取“螃蟹腳”的供試樣品溶液，分別與0、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定峰面積，結(jié)果楊梅素、槲皮素和山柰酚的RSD 均小于2.0%，表明供試樣品24 h 內(nèi)穩(wěn)定性好。

圖1 楊梅素、槲皮素和山柰酚標(biāo)樣及“螃蟹腳”中黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of (A)myricetin，quercetin and kaempferol standards，(B)V.articulatum Burm sample

考察最低檢出量和最低定量值、HPLC 的精密度、穩(wěn)定性及建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可以認(rèn)為此方法能較好的對(duì)黃酮醇進(jìn)行定性定量分析。

2.2 “螃蟹腳”中黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的組成與含量

2.2.1 “螃蟹腳”中黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的組成

圖1(A)是楊梅素、槲皮素和山柰酚標(biāo)樣的HPLC 色譜圖，從圖1(A)可以看出，在選定的分析條件下，楊梅素、槲皮素和山柰酚分別在15. 624、18.233 min 和21.735 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了良好的分離。

圖1(B)是“螃蟹腳”經(jīng)1.3.3 的方法處理后，HPLC 檢測(cè)到的黃酮醇類(lèi)物質(zhì)組成的情況。從圖可知，“螃蟹腳”中檢測(cè)到了峰面積較大的9 個(gè)組分，其中，保留時(shí)間為15.450 min(峰6)的組分通過(guò)在線(xiàn)VWD 紫外-可見(jiàn)光譜掃描與楊梅素標(biāo)樣有相同的吸收光譜，保留時(shí)間與楊梅素標(biāo)樣的保留時(shí)間(15.624 min)近乎一至，由此可以判斷“螃蟹腳”中含有楊梅素;另外，峰7(18.679 min)和峰8(21.745 min)的保留時(shí)間與槲皮素和山奈酚標(biāo)樣的保留時(shí)間相似，初步判斷“螃蟹腳”中含有槲皮素和山奈酚。其余分別在保留時(shí)間為2.868 min(1)、6.643 min(2)、7.785 min(3)、8.429 min(4)、9.811 min(5)和22.951 min(9)時(shí)檢測(cè)到的峰面積較大的6個(gè)未知組分的成分還有待進(jìn)一步的研究。

2.2.2 “螃蟹腳”中楊梅素、槲皮素、山奈酚及黃酮類(lèi)化合物的含量

表2 為“螃蟹腳”中楊梅素、槲皮素、山奈酚HPLC 定量分析和黃酮類(lèi)化合物總含量的測(cè)定結(jié)果。從表2 可知，“螃蟹腳”中黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的含量相對(duì)較少，已知的楊梅素、槲皮素和山奈酚三種單體成分中楊梅素的含量為0.16 mg/g，遠(yuǎn)高于其余兩類(lèi)的含量。本文參照文獻(xiàn)1 提取“螃蟹腳”中黃酮類(lèi)化合物的最佳提取條件和方法，提取了“螃蟹腳”中黃酮類(lèi)化合物，采用三氯化鋁比色法測(cè)定了其總含量，從結(jié)果可看出，“螃蟹腳”中總黃酮含量達(dá)7.65 mg/g。

表2 “螃蟹腳”中楊梅素、槲皮素、山奈酚及黃酮類(lèi)化合物的總含量Table 2 The concentrations of myricetin，Quercetin and kaempferol and flavonoids in Viscum articulatum Burm

2.3 “螃蟹腳”中黃烷醇類(lèi)物質(zhì)的組成及總多酚含量

“螃蟹腳”寄生在多年生的古茶樹(shù)上，而茶葉富含黃烷醇類(lèi)物質(zhì)，為了明確作為茶樹(shù)寄生植物的“螃蟹腳”中是否含有黃烷醇類(lèi)物質(zhì)，本文以茶葉中含量最多的4 種主要兒茶素為標(biāo)樣，用HPLC 法檢測(cè)了“螃蟹腳”的黃烷醇類(lèi)物質(zhì)。圖3(a)是4 種茶葉中主要的黃烷醇類(lèi)物質(zhì):表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)混合標(biāo)樣的HPLC 色譜圖;圖3(b)是“螃蟹腳”黃烷醇類(lèi)物質(zhì)組成的HPLC 色譜圖;圖3(c)是“螃蟹腳”供試液中加入上述4 種兒茶素混標(biāo)后的HPLC 色譜圖。由圖3 可知:“螃蟹腳”樣品含有與EGC、EGCG 和ECG保留值相似的組分，且加入混標(biāo)后，3 個(gè)組分的峰高與峰面積增大，初步表明“螃蟹腳”中可能含有該3種兒茶素。但是，通過(guò)酒石酸鐵比色法所測(cè)得的“螃蟹腳”中多酚類(lèi)物質(zhì)的總含量?jī)H為0.84%，含量遠(yuǎn)低于茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的含量。

圖2 4 種主要兒茶素及“螃蟹腳”中黃烷醇類(lèi)物質(zhì)的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of four catechins (EGC，EC，EGCG and ECG)(a)，flavanols of V. articulatum Burm (b)，and mixture of four catechins (EGC，EC，EGCG and ECG)and flavanols (c).

3 討論

“螃蟹腳”是在上百年的古茶樹(shù)才能找得到的一種寄生植物，目前由于過(guò)量采摘，野生數(shù)量已極為稀少，而且因其在野生狀態(tài)下生長(zhǎng)極為緩慢，其資源也面臨著危機(jī)，因此，利用現(xiàn)代的分析手段對(duì)其功效成分的研究顯得尤為重要。但是由于受“螃蟹腳”寄主植物特殊性的影響，材料的獲得與收集具有一定的困難，導(dǎo)致對(duì)其內(nèi)含成分的研究相對(duì)匱乏，目前僅有楊鳳賢等對(duì)其黃酮類(lèi)化合物的提取工藝作了研究?；诖搜芯楷F(xiàn)狀，本文應(yīng)用HPLC 法對(duì)“螃蟹腳”中黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的組分與含量，黃烷醇類(lèi)(兒茶素)的組分進(jìn)行了分析研究，從“螃蟹腳”中檢測(cè)到了包括楊梅素、槲皮素、山柰酚在內(nèi)的9 個(gè)(圖1B)黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的組分和包括EGC、EGCG、ECG 在內(nèi)的黃烷醇類(lèi)(兒茶素)組分。另外，通過(guò)HPLC 定量分析，“螃蟹腳”樣品中楊梅素、槲皮素和山柰酚的含量分別為:0.16、0.03 和0.05 mg/g;通過(guò)三氯化鋁比色法測(cè)定“螃蟹腳”樣品中黃酮類(lèi)化合物的總含量為7.65 mg/g;酒石酸鐵法測(cè)定“螃蟹腳”樣品中茶多酚的含量?jī)H為0.84%，遠(yuǎn)低于茶葉中茶多酚的含量。上述研究結(jié)果在一定程度上為今后進(jìn)一步深入開(kāi)展“螃蟹腳”中黃酮醇及黃烷醇類(lèi)(兒茶素)物質(zhì)單體成分的提取分離及化學(xué)結(jié)構(gòu)式的鑒定研究、構(gòu)效關(guān)系的研究等提供了參考和理論依據(jù)。

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