尚曉婭 ，張 媛，白艷玲，牛衛(wèi)寧，徐春蘭，欽傳光

西北工業(yè)大學，西安710072

絞股藍(Gynostemma pentaphyllum Makino)為葫蘆科絞股藍屬多年生草質(zhì)藤本植物，又稱七葉參、七葉膽、甘茶蔓［1，2］。目前，全世界已知絞股藍植物有13 種，我國占11 種，其中7 種為我國獨有，陜西安康、平利、洋縣、嵐皋等縣市進行的絞股藍野生人工馴化栽培已成為我國絞股藍最大的人工栽植基地。近年來研究發(fā)現(xiàn)多糖是絞股藍的有效活性成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血壓等諸多藥理作用［3，4］。Wang 等［5］研究了絞股藍粗多糖以及其三個均一組分的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)粗多糖比均一組分清除超氧自由基的能力更強，但是粗多糖和均一組分對脂質(zhì)過氧化的抑制作用未知。除此之外，精制多糖與粗多糖相比，其抗氧化活性是否更好?這些問題均需要進一步研究與探討。本文系統(tǒng)研究絞股藍粗多糖和精制多糖在體外對DPPH、羥自由基的清除能力、對小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化和Fe2+-H2O2誘導的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制作用以及還原能力，以期為絞股藍營養(yǎng)物質(zhì)基礎(chǔ)闡明和功能食品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍購于陜西省平利縣絞股藍栽培基地，烘干備用。

D-葡萄糖(Glu)、D-甘露糖(Man)、D-阿拉伯糖(Ala)、D-半乳糖(Gal)、D-木糖(Xyl)、L-鼠李糖(Rha)、L-巖藻糖(Fuc)、D-核糖(Rib)、D-脫氧核糖(Deo)，美國Sigma 公司。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，美國Sigma公司;Tris-Base 0497 超級純，美國Amresco 公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氟乙酸(TCA)、三氯化鐵、甲醇、水楊酸、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、亞硝酸鈉、鎢酸鈉、氯化鈉、30%H2O2、乙醚、氯仿、正丁醇、無水乙醇、丙酮、鄰苯三酚、硫代巴比妥酸(TBA)、抗壞血酸(Vc)等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(上海精密科學儀器有限公司);U-3310 紫外可見分光光度計(日本HITACHI 公司);6890 型氣相色譜儀(美國Agilent 公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);DK-600S 型三用恒溫水箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);TG16A-WS 臺式高速離心機，GL-22M 高速冷凍離心機(湖南塞特湘儀離心機儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 絞股藍粗多糖的制備

取200 g 干絞股藍，用95%乙醇在50 ℃回流提取3 次，去掉上清液，收集濾渣。將濾渣用蒸餾水在95 ℃提取2 次，每次1.5 h，收集提取液，離心，收集上清液。將上清液濃縮，加入4 倍體積的乙醇，4 ℃放置一整夜以沉淀多糖，離心，收集沉淀，分別用乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀，冷凍干燥，得到灰白色絞股藍粗多糖(GPMPP)粉末。

1.3.2 絞股藍精制多糖的制備

將10 g 粗多糖加蒸餾水復溶配成5%粗多糖溶液，加入1/5 體積Sevag 試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，劇烈震蕩，離心，取上清液，加1/5 體積Sevag 試劑，如此重復多次，直至無白色中間層沉淀。收集上清液濃縮，分別用自來水和蒸餾水透析，加入4 倍體積乙醇，4 ℃放置一整夜，離心，收集沉淀，分別用乙醇、丙酮和乙醚洗滌沉淀，冷凍干燥，得到白色絞股藍精制多糖(GPMP)粉末。

1.3.3 紫外光譜分析

取絞股藍精制多糖(GPMP)1 mg 左右，加適量水溶解，在波長190～600 nm 范圍內(nèi)進行掃描，以蒸餾水作為空白。

1.3.4 多糖中單糖組成成分分析

取5 mg 精制多糖樣品，加入1.5 mL 5 mol/L 三氟乙酸溶液，封管，100 ℃水解6 h，離心除去殘渣，減壓濃縮至干，用去離子水洗滌，減壓濃縮至干，重復5 次，除去殘留的三氟乙酸。

多糖水解物制成糖腈乙酸酯衍生物，進行氣相色譜分析，色譜柱為石英毛細管柱DB-1701(30 m×0.25 mm ×0.25 μm)，程序升溫:110 ℃(3 min)～210 ℃(30 min)，20 ℃/min，氫火焰離子化檢測器(FID)，N2流速:1.0 mL/min。

1.3.5 絞股藍多糖抗氧化活性測定

1.3.5.1 總還原能力

參考Lin 等的方法［6］。0.4 mL 不同質(zhì)量濃度的粗多糖或精制多糖溶液與0.4 mL 0.2 mol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 6.6)和0.4 mL 1%鐵氰化鉀混合，50 ℃孵育20 min，加入0.4 mL 10%三氯乙酸(w/v)，混和物在200 g 離心10 min，上清液(0.8 mL)與0.8 mL 去離子水，0.16 mL 0.1%三氯化鐵混合，在700 nm 處測吸光度。反應(yīng)后的生成物在700 nm 處的吸光度的大小即反映了其還原能力的大小。蒸餾水作陰性對照，Vc 作陽性對照。

1.3.5.2 清除DPPH 自由基活性

參考Kong 等的方法［7］。不同質(zhì)量濃度的粗多糖或精制多糖溶液0.4 mL 與0.4 mL 0.2 mmol/L DPPH 甲醇溶液混合，混勻，避光放置30 min 后，用紫外分光光度計在517 nm 處測吸光度。蒸餾水作陰性對照，Vc 作陽性對照。計算清除率:

樣品組:DPPH +測試樣品;對照組:DPPH +樣品溶劑

1.3.5.3 清除羥基自由基活性

參考Fenton 反應(yīng)體系模型［8］。采用固定時間反應(yīng)法，在相同反應(yīng)體積的反應(yīng)體系內(nèi)(8.8 mmol/L H2O20.2 mL，9 mmol/L FeSO40.2 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.2 mL)，加入不同質(zhì)量濃度的粗多糖或精制多糖溶液0.4 mL，在510 nm 處測吸光度A。蒸餾水作陰性對照，Vc 作陽性對照。計算清除率:

1.3.5.4 抑制小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化作用

參考Ke 等的方法［9］。取2.5% 肝勻漿懸浮液2 mL，加入不同質(zhì)量濃度的粗多糖或精制多糖溶液0.4 mL，37 ℃水浴60 min，加入15% TCA 2 mL 終止反應(yīng)，再加入0.67% TBA 2 mL，于沸水浴中顯色15 min，冷卻后離心，取上清液于532 nm 處測吸光度A。蒸餾水作陰性對照，Vc 作陽性對照。計算抑制率:

1.3.5.5 抑制Fe2+-H2O2誘導的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化作用

參考Amaral 等的方法［10］。取2.5% 肝勻漿懸浮液1 mL，加入不同質(zhì)量濃度的粗多糖或精制多糖溶液0.4 mL，再加入6 mmol/L FeSO4溶液0.1 mL和60 mmol/L H2O240 μL，37 ℃水浴60 min，加入15% TCA 1 mL 終止反應(yīng)，再加入0. 67% TBA 1 mL，于沸水浴中顯色15 min，冷卻后離心，取上清液于532 nm 測吸光度A。蒸餾水作陰性對照，Vc 作陽性對照。計算抑制率:

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜分析

GPMP 水溶液在波長區(qū)段190 nm～400 nm 的紫外光譜掃描圖見圖1。從圖中可見，GPMP 在190 nm 處附近有最大吸收峰，其為多糖的特征吸收峰。核酸的特征吸收峰在260 nm 處，多肽、蛋白質(zhì)的特征吸收峰在280 nm 處，GPMP 在波長260 nm 和280 nm 附近均沒有顯示明顯的吸收峰，表明GPMP 不含有核酸、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，純度較高。

圖1 GPMP 的紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of GPMP

2.2 絞股藍多糖單糖組成分析

圖2 是9 種單糖標準品的氣相色譜圖，9 種單糖標準品按照保留時間不同，其出鋒順序依次為脫氧核糖(Deo)、鼠李糖(Rha)、核糖(Rib)、巖藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)。圖3 是絞股藍精制多糖GPMP 水解后的氣相色譜圖。對照單糖標準品在GC 上的保留時間和GPMP 水解后在GC 上的保留時間，可知GPMP 由鼠李糖(7. 43%)、阿拉伯糖(20.18%)、木糖(5.36%)、甘露糖(8.78%)、葡萄糖(26.71%)和半乳糖(31.54%)組成，物質(zhì)的量比為1.39∶3.76∶1.00∶1.64∶4.98∶5.88。其主要的單糖組分是半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖，其物質(zhì)的量分數(shù)達到78.43%。

2.3 抗氧化結(jié)果及分析

2.3.1 絞股藍多糖總還原力的測定

一般情況下，物質(zhì)的還原能力越強，其抗氧化活性也越高。從圖4 可知，在實驗濃度范圍內(nèi)，絞股藍粗多糖GPMPP 和精制多糖GPMP 還原力測試混合液的吸光度隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，并表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。GPMPP 的濃度為1 mg/mL 時，對應(yīng)的吸光度值為0.642;濃度上升到5 mg/mL 時，對應(yīng)的吸光度值相應(yīng)增加到1. 618。而精制多糖GPMP 的還原能力明顯低于粗多糖，GPMP 的濃度為1 mg/mL 時，對應(yīng)的吸光度值為0.148;濃度上升到5 mg/mL 時，對應(yīng)的吸光度值相應(yīng)增加到0. 513。絞股藍粗多糖的還原能力高于精制多糖，其原因可能是因為在除蛋白的過程中粗多糖的某些氫鍵斷裂造成多糖空間結(jié)構(gòu)的改變，導致精制多糖GPMP 的還原能力減弱。

圖4 絞股藍多糖的總還原力Fig.4 Reducing power of the polysaccharides from G.pentaphyllum Makino

2.3.2 絞股藍多糖對DPPH 自由基的清除能力

從圖5 可以看出，Vc 清除DPPH 自由基的能力非常強，在濃度為0.1 mg/mL 時，其清除率就已分別達到94.64%，濃度繼續(xù)增加幾乎達到100%。粗多糖GPMPP 對DPPH 自由基的清除率隨著多糖濃度的增加呈增長趨勢，并且濃度達到3 mg/mL 時逐漸趨于平衡，濃度大于3 mg/mL 時清除率增長不明顯。精制多糖GPMP 對DPPH 自由基的清除率隨著多糖濃度的增加也呈明顯的增長趨勢，并且表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。當GPMP 濃度為1 mg/mL 時其清除率僅為19.79%，而濃度為3 mg/mL 時清除率增加到44.42%，濃度再增加到5 mg/mL 時清除率高達63.41%。絞股藍粗多糖對DPPH 自由基的清除能力高于精制多糖，這與前面還原力的結(jié)果一致，除了上述原因，還有可能是因為粗多糖液中除多糖成分外，還有部分蛋白質(zhì)、色素等其他成分，而蛋白質(zhì)和色素有一定的清除DPPH 自由基的活性，因此在兩者協(xié)同作用下達到了較高的清除活性。

2.3.3 絞股藍多糖對羥自由基的清除能力

從圖6 可知，粗多糖GPMPP 和精制多糖GPMP對H2O2/Fe2+體系通過Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的·OH 都具有清除作用，且隨著多糖濃度的增加，清除率上升，當濃度高于3 mg/mL 時，清除率上升緩慢，趨于平穩(wěn)。GPMPP 的濃度為1 mg/mL 時，其對·OH 的清除率接近50%;而GPMP 的濃度僅為0.5 mg/mL時，其對·OH 的清除率已達到50%，說明在相同時間內(nèi)GPMP 對·OH 的清除作用比GPMPA 要強。從圖中我們還可以發(fā)現(xiàn)，精制多糖GPMP 對·OH的清除能力非常強，可與Vc 相抗衡。當GPMP 濃度為1 mg/mL 時，此時對·OH 的清除率已超過80%，當濃度達到5 mg/mL 時，清除率高達99%以上，比相同濃度的Vc 還要高。可能因為精制多糖GPMP 的純度較高，其成分為多糖，不含有其他雜質(zhì)，而多糖在清除·OH 能力方面具有其獨特的優(yōu)勢。

2.3.4 絞股藍多糖對小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的作用

從圖7 可以看出，絞股藍多糖GPMPP 和GPMP各劑量對小鼠肝勻漿自氧化MDA 的形成有明顯的抑制作用，且隨添加劑量的增加，抑制效果較好。在實驗濃度范圍內(nèi)，粗多糖GPMPP 的抑制率要明顯高于精制多糖GPMP，但是粗多糖在濃度達到3 mg/mL 以上時，其抑制率不再增加，而精制多糖的抑制率則隨著濃度的增大而明顯增加。粗多糖GPMPP在較高濃度時，其抑制率比Vc 要高，表明絞股藍多糖在抑制小鼠肝勻漿自氧化MDA 的形成方面具有很大的潛力。

圖7 絞股藍多糖對小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的作用Fig.7 Effects of the polysaccharides from G. pentaphyllum Makino on liver lipid peroxidation

2.3.5 絞股藍多糖對Fe2+-H2O2誘導的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化的作用

亞鐵離子和雙氧水是很強的自由基誘導劑，在小鼠肝勻漿中添加自由基誘導劑后其自氧化產(chǎn)生的MDA 量顯著增加。從圖8 可知，在這兩種物質(zhì)存在的體系下，絞股藍多糖表現(xiàn)出較強的抑制MDA 生成活性。劑量為5 mg/mL 時，粗多糖和精制多糖的抑制率分別為49.35%和53.53%。表明絞股藍多糖可能是通過對自由基產(chǎn)生的抑制作用來抑制肝組織自氧化，從而達到保護肝組織的目的。

圖8 絞股藍多糖對Fe2+-H2O2 誘導的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化的作用Fig.8 Effects of the polysaccharides from G. pentaphyllum Makino on liver lipid peroxidation induced by Fe2+-H2O2

3 結(jié)論

對絞股藍粗多糖和精制多糖的研究表明，絞股藍多糖具有較好的還原能力，對DPPH 自由基和·OH 具有較強的清除能力，并且對小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化和Fe2+-H2O2誘導的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化具有較好的抑制作用。與精制多糖GPMP 相比，粗多糖GPMPP 的還原能力、清除DPPH 自由基的能力以及對小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用更好;與粗多糖GPMPP 相比，精制多糖GPMP清除·OH 的能力以及對Fe2+-H2O2誘導的小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制作用更好。

絞股藍粗多糖在抑制小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化方面比Vc 要好，絞股藍精制多糖在清除·OH方面也能與Vc 抗衡，表明絞股藍多糖具有良好的抗氧化活性，具有開發(fā)成天然抗氧化劑的潛力。

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