張秋龍，梁永欣，李文聰，索有瑞，丁晨旭* ，王洪論

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧810001;2 中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049;3 青海民族大學(xué)，西寧810007

藏藥角茴香(Hypecoum leptocarpum Hook. f. et Thoms)為罌粟科角茴香屬植物［1］，別名咽喉草、山黃連或野茴香等，藏藥名為巴爾哇打、巴爾巴達(dá)。生長(zhǎng)于海拔4.300 km 以下的草原、草甸、砂礫地上［2］，味苦性涼，清血熱、溫?zé)岷投緹幔?］。《西藏常用中草藥》稱其有解熱鎮(zhèn)痛、消炎解毒之功效，可治傷風(fēng)感冒、頭痛、四肢關(guān)節(jié)疼痛、膽囊炎，并解食物中毒?！蛾兏蕦幥嘀胁菟庍x》中稱:細(xì)果角茴香能治流感、咽喉腫痛、目赤等癥?，F(xiàn)代分析化學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn):細(xì)果角茴香中含有多種生物堿成分，如:原阿片堿、隱品堿、血根堿等［4］。但國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)關(guān)于細(xì)果角茴香中其它化學(xué)成分如總黃酮的含量研究尚少見(jiàn)報(bào)道，劉永紅等人［7］曾用甲醇為提取溶劑，采用正交法研究過(guò)提取工藝，本文用乙醇代替毒性較大的甲醇，采用超聲波輔助提取法［5，6］，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用響應(yīng)面法［8，9］優(yōu)化細(xì)果角茴香中總黃酮的提取工藝，為細(xì)果角茴香的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供更精確的科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細(xì)果角茴香:采收于青?；ブh北山，經(jīng)中科院西北高原生物研究所中藥學(xué)專家索有瑞研究員鑒定，自然風(fēng)干，粉碎;蘆丁，購(gòu)于北京生物醫(yī)藥公司;其它化學(xué)試劑均為分析純。

儀器:T6 新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);KQ-500E 型超聲波清洗器(500W)，昆山市超聲儀器有限公司;N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司;AL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SHZ-3 型循環(huán)水多用真空泵，上海亞榮生化儀器廠;DLSB-5/20 低溫冷卻循環(huán)泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的配制

精確稱取120 ℃干燥恒重的蘆丁標(biāo)樣10 mg，用30%乙醇溶解并定容于50 mL 容量瓶中，搖勻，即得濃度為0.2 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 吸收曲線繪制

準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)液5.00 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線下的測(cè)定方法，在450～600 nm 處測(cè)定吸收光譜，在510 nm 處有最大吸收，故選擇510 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0. 00、1. 00、2. 00、3.00、4.00、5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，用30%乙醇稀釋至10 mL，加入1.0 mL5%NaNO2溶液搖勻，立刻加入1. 0 mL 10% Al(NO3)3搖勻，放置10 min。加入5 mL 1 mol/L NaOH 溶液，用30%乙醇定容，混合后搖勻，放置10 min，以試劑空白為參比，在510 nm 處測(cè)吸光度值。以蘆丁的濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A = 10. 39C-0. 0018，r =0.9991。

1.2.4 超聲提取

細(xì)果角茴香粉碎后過(guò)40 目篩，稱取1 g，加60%乙醇30 mL，浸泡15 min 后，在50 ℃下超聲30 min，抽濾。待樣品冷卻到室溫再進(jìn)行下一次處理。合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，濃縮后用乙醇定溶于50 mL 容量瓶中備用。實(shí)驗(yàn)分別考察了乙醇溶液濃度、液料比、提取溫度、超聲提取時(shí)間等因素對(duì)細(xì)果角茴香中總生物堿得率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)三個(gè)對(duì)總黃酮提取率影響較大的因素，對(duì)提取條件進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化提取工藝條件。

1.2.5 含量測(cè)定

吸取2 mL 濾液于25 mL 容量瓶中，按照標(biāo)曲下的測(cè)定方法測(cè)吸光度，計(jì)算含量、得率。

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

以乙醇為提取溶劑，主要考察乙醇溶液濃度、液料比、提取溫度、超聲提取時(shí)間等因素對(duì)細(xì)果角茴香中總生物堿得率的影響。

1.2.7 細(xì)果角茴香中總黃酮的提取工藝優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在50 ℃下以乙醇溶液為提取劑，選取對(duì)總黃酮影響較大的因素乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、液料比(C)，進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)條件選取合理水平。以總黃酮的得率為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面分析得出超聲波提取細(xì)果角茴香中總黃酮的最佳提取工藝條件和方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素編碼及水平見(jiàn)表1。

表1 中心組合設(shè)計(jì)因素與水平表Table 1 Factors and levels of the central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)細(xì)果角茴香總黃酮得率的影響

2.1.1 乙醇溶液濃度對(duì)細(xì)果角茴香中總黃酮提取率的影響。

固定提取時(shí)間30 min，提取溫度50 ℃，液料比30∶1，選擇乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%按照1.1.4 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇溶液濃度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

由圖1 可知，在乙醇濃度60%左右提取率最大，因此選擇乙醇濃度在60%左右為宜。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)細(xì)果角茴香中總黃酮提取率的影響

固定乙醇濃度60%，提取溫度50 ℃，液料比30∶1 mL/g，選擇超聲時(shí)間分別為20、25、30、35、40 min，按照1.1.4 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

由圖2 可知，在10～30 min 內(nèi)，總黃酮的提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，30 min 以后，總黃酮得率變化不大。為了節(jié)能超聲處理時(shí)間在30 min左右為宜。

2.1.3 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響。

固定提取溫度50 ℃，乙醇濃度60%，提取時(shí)間30 min，選擇液料比分別為20、25、30、35、40，按照1.1.4 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 液料比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ratio of liquid to solid on extraction yield of total flavonoids

由圖3 可知，當(dāng)料液比達(dá)到30∶1 左右時(shí)，總黃酮基本溶出，再增加提取劑用量，提取率變化不大。因而，液料比30∶1 左右為宜。

2.1.4 溫度對(duì)總黃酮提取率的影響。

固定乙醇濃度60%，提取時(shí)間30 min，液料比為30∶1，選擇提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，按照1.1.4 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of total flavonoids

由圖4 可知，總黃酮的提取率隨著溫度的提高而提高。溫度的升高會(huì)加強(qiáng)溶液中各分子的運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)擴(kuò)散作用，有利于提高提取率，但溫度過(guò)高有可能破壞黃酮的結(jié)構(gòu)而降低其含量，故選擇提取溫度應(yīng)為50 ℃。

2.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

利用DesignExpert8.0.7.1 軟件，通過(guò)表2 中總黃酮得率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出回歸模型方差分析表和響應(yīng)曲面圖，分別見(jiàn)表3 和圖5。

表2 Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiments design and the results of these experiments

120001.179 131011.409 140001.498 15-1-101.450 160001.363 171101.457

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

圖5 各兩因素交互作用對(duì)總生物堿提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of mutual influences of extraction conditions on the extraction yields of total flavonoids

通過(guò)擬合可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，多元回歸擬合分析得到細(xì)果角茴香總黃酮提取率Y 與各因素變量(A 乙醇濃度，B 提取時(shí)間，C 液料比)的二次方程模型為:Y = 1. 48-0. 024 × A + 0. 050 × B + 0. 13 × C +5.500E-003 ×A×B+ 4.500E-00 ×A ×C-0.036 ×B×C-0.055 ×A2-0.015 ×B2-0.081 ×C2

從表3 中方差分析結(jié)果可知方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響均極顯著，說(shuō)明分析結(jié)果可靠;從試驗(yàn)所得的響應(yīng)面分析結(jié)果可以找到它們?cè)谔崛∵^(guò)程中的交互作用，如表3 和圖5 可知提取時(shí)間和液料比之間的交互作用顯著，其余項(xiàng)間的交互作用不明顯。根據(jù)Design Expert 8.0.7.1 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化分析，確定最佳的提取條件為:乙醇濃度58%，提取時(shí)間34.55 min，液料比32.95 mL/g，在此條件下預(yù)測(cè)總黃酮的得率為1.538%。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)模型預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行近似驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，但考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件修正為乙醇濃度58%，提取時(shí)間34.50 min，液料比33 mL/g，在此條件下總黃酮提取率為1.525%(n=3)。

3 結(jié)論

用超聲法提取細(xì)果角茴香中總黃酮，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)工藝條件為:乙醇濃度58%，提取時(shí)間34.50 min，液料比33 mL/g。在此工藝條件下，總黃酮提取率為1.525%(n =3)。該研究結(jié)果對(duì)細(xì)果角茴香中總黃酮的提取研究提供一定的參考價(jià)值，具有一定的實(shí)際應(yīng)用前景。

1 Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences(中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所). Flora Qinghaiica(青海植物志)，Vol 1.Xining:Qinghai People’s Publishing House，1997.393.

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