榮 輝，林祥志 ，王龍梅，蘇永全

1廈門大學海洋與地球學院;2國家海洋局第三海洋研究所，廈門361005

非蛋白質氨基酸是指除組成蛋白質的20 種常見氨基酸以外的含有氨基和羧基的化合物。非蛋白質氨基酸多為蛋白氨基酸的類似物或取代衍生物，如甲基化、磷酸化、羥化、糖苷化、交聯等等。除此之外，還包括β、γ、δ 氨基酸及D-氨基酸［1］。非蛋白質氨基酸多以游離或小肽的形式存在于生物的各種細胞或組織中。據統計，從動物、植物、微生物體內分離得到的非蛋白質氨基酸已達700 余種，其中已測定分子結構的有400 多種，在植物中發(fā)現的約240種，動物中發(fā)現的有50 多種，其余多存在于微生物中［2］。非蛋白質氨基酸可以作為合成其它含氮物質的前身，如激素、抗生素、生物堿、色素等，還可作為組成細菌細胞壁的成分。非蛋白質氨基酸還可參與儲能，充當神經遞質，參與跨膜離子通道的形成，并在抗癌、抗菌、抗結核、護肝、降血壓、升血壓等方面都發(fā)揮了極其重要的作用［3］。

銅藻Sargassum horneri (Turn.)C. Ag. 屬于馬尾藻屬，是非食用海藻，主要分布于我國東海、南海沿岸，資源相當豐富，常用作飼料、藻膠、飲料的原料，部分地區(qū)作為中藥海藻使用。目前已從馬尾藻中發(fā)現多類具有生物活性的化合物，主要有甾類化合物、萜烯類化合物、甘油糖脂、間苯三酚衍生物及其聚合物等物質，銅藻的化學成分研究較少，僅報道含褐藻酸、甘露醇、多糖、甾醇等［4］。本論文主要開展了銅藻中游離非蛋白質氨基酸的檢測分析、部分分離及結構鑒定研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

銅藻Sargassum horneri (Turn.)C.Ag.:采自中國福建沿海，由汕頭大學丁蘭平教授鑒定，保存在國家海洋局第三海洋研究所藻類種質資源庫內。

1.2 試劑及儀器

氨基酸混合標準品(Sigma)，PITC(異硫氰酸苯酯，Sigma)，乙腈、正己烷、甲醇等均為色譜純，HCl(優(yōu)級純)，其他試劑均為分析純。

主要儀器:高效液相色譜儀(日本島津，LC-20A)，半制備高效液相色譜儀(日本島津，LC-8A)，核磁共振儀(美國Bruker，Metcurty-400)，紅外光譜儀(美國Bruker，VERTEX 70)，高分辨質譜儀(美國Waters，LCT Premier XE)。

1.3 銅藻游離氨基酸的分離

取一定量粉碎的銅藻藻粉用75%的乙醇(料液比為1∶5)浸泡24 h，然后40 ℃超聲提取30 min，共三次。旋蒸濃縮至無乙醇(40 ℃下)，將水相用乙酸乙酯(水相∶乙酸乙酯為1∶1～5)萃取三次，留水相。將水相濃縮至一定體積，過陽離子交換樹脂，接3 mol/L 氨水洗脫液，濃縮至干，用0.1 mol/L 的HCl定容，待檢測分析。

1.4 PITC-HPLC 柱前衍生反相高效液相色譜法檢測［5］

1.4.1 色譜條件

色譜柱:Inertsil ODS-SP C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm);柱溫38 ℃;SPD-M20A 檢測器，檢測波長254 nm;進樣量10 μL 。流動相A:0.1 mol/L 醋酸鈉(用冰乙酸調pH 為6.5)-乙腈(體積比為97∶3)的溶液;流動相B:乙腈-水(體積比為4∶1)的溶液。線性洗脫程序:0.0 min，0%B;13 min，7%B;23 min，23%B;29 min，35%B;35 min，40%B;40 min，100%B;45 min，100%B;47 min，0%B。流速為1.0 mL/min。

A 的配制:3 g 醋酸鈉溶解在370 mL 水中，用冰乙酸調pH 至6.5，加入28 mL 乙腈，用0.45 μm 的濾膜過濾。

1.4.2 對照品混合溶液和樣品的衍生

取對照品混合溶液或樣品200 μL 置于離心管中，加入0. 1 mol/L PITC -乙腈溶液100 μL，1. 0 mol/L 三乙胺-乙腈溶液100 μL，混勻，室溫下放置1 h 后加入400 μL 正己烷，漩渦混合器振蕩1 min，靜置10 min。用移液器吸取下層溶液，經0.22 μm 濾膜過濾后進樣進行色譜分析。

PITC-乙腈溶液:36 μL PITC 和2.164 mL 乙腈混合。

三乙胺-乙腈溶液:417 μL 三乙胺和2.583 mL乙腈混合。

1.5 未知組分的制備分離

為確定檢測到的未知組分的結構，采用半制備型高效液相色譜儀對衍生后的游離氨基酸粗提物進行制備分離。收集到的目標產物濃縮后經不加醋酸鈉的流動相再次分離除去鹽后經旋蒸除去有機溶劑，再進行冷凍干燥，收集樣品待結構鑒定。

色譜柱:Shim-Pack PRC-ODS(20 × 250 cm);SPD-20A 檢測器，檢測波長254 nm;進樣量5 mL。流動相A:0.1 mol/L 醋酸鈉(用冰乙酸調pH 值為6.5)-乙腈(97∶3，v/v)的溶液;流動相B:乙腈-水(4∶1，v/v)的溶液。線性洗脫程序:0.0 min，0%B;13 min，7% B;23 min，23% B;29 min，35% B;35 min，40%B;40 min，100%B;45 min，100%B;47 min，0%B。流速為18 mL/min。

1.6 未知組分的結構鑒定

將制備分離到的高純化合物樣品分別進行核磁共振波譜(400 M)、高分辨質譜、紅外光譜分析以確定其結構。

2 結果與分析

2.1 銅藻游離氨基酸的分離

銅藻粉末先經乙醇超聲提取，再經乙酸乙酯萃取，最后經陽離子交換樹脂層析除去大量的蛋白質、脂質、多糖等，所收集的3 mol/L 氨水組分經茚三酮乙醇溶液顯色反應后發(fā)現，其含有高濃度的氨基酸組分，隨后并進行了PITC-HPLC 法檢測分析。此分離方法運用有機溶劑和超生萃取相結合的方式，減少了提取時間，且增加了提取效果。

2.2 PITC-HPLC 法檢測分析

2.2.1 線性關系分析

分別取100，50，25，10，5 μL 的對照品混合氨基酸標準溶液，使其按照上述方法進行衍生，以各種氨基酸峰面積Y 為縱坐標，氨基酸實際摩爾濃度X 為橫坐標，進行線性回歸分析。結果表明17 種氨基酸在0.078～1.25 mol/L 與峰面積比具有良好的線性關系。氨基酸混合標準品液相色譜圖和得到的每種氨基酸的線性回歸方程分別見圖1 和表1。

圖1 17 種混合氨基酸標準品液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of the mixed standard samples by PITC-HPLC

表1 17 種氨基酸的線性回歸方程Table 1 The linear regression equations of 17 kinds of amino acids

2.2.2 方法的精密度、重復性及穩(wěn)定性試驗

取對照品溶液200 μL 按照上述方法衍生后連續(xù)進樣5 次，以色譜峰峰面積為指標計算RSD，考察其精密度，17 種氨基酸標準溶液的精密度試驗RSD在0.20%2.49% (n =5)，均在允許范圍內;取對照品溶液200 μL 按照上述方法衍生后分別在0、4、8、12、24、48、56 h 進樣，以色譜峰峰面積為指標計算RSD，考察其穩(wěn)定性，17 種氨基酸標準溶液的穩(wěn)定性試驗RSD 在0.28%～1.31%(n =7)，均在允許范圍內;取同一批銅藻樣品5 份，按上述方法提取、衍生、測定，以色譜峰峰面積為指標分別計算RSD，考察方法的重復性，銅藻所含各種氨基酸峰面積的RSD 在0.70%～2.23%，同樣均在允許范圍內。

2.2.3 回收率試驗

吸取已知含量的銅藻樣品100 μL，準確加入氨基酸混標100 μL，按照上述方法分別衍生、進樣，外標法定量，如此平行5 次，計算各氨基酸的回收率和相對標準偏差，平均回收率在78.50%～101.82%，相對標準偏差在0.51%～3.45%，均在允許范圍內。

2.2.4 PITC-HPLC 檢測結果

通過與17 種混合標準品液相色譜圖比較分析發(fā)現銅藻樣品中除了蛋氨酸、胱氨酸外包含15 種其他常見蛋白質氨基酸及3 種未知組分，且含量較高的常見蛋白質氨基酸為丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸。3種未知組分的衍生物分別為MWZ1(6. 3 min)、MWZ2(12.9 min)、MWZ3(26.6 min)，見圖2。

圖2 銅藻樣品液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of Sargassum horneri (Turn..)Ag. sample by PITC-HPLC

2.3 制備分離

由于3 種未知組分衍生物中MWZ1、MWZ3 的含量過低而未進行制備分離，最終采用半制備高效液相色譜系統制備分離到1 種未知衍生組分MWZ2，其制備分離HPLC 色譜圖分別如圖3，MWZ2 的出峰時間為10.6 min。收集未知組分經無鹽流動相除鹽后旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑，再經真空冷凍干燥后MWZ2 為略黃固體粉末。

圖3 MWZ2(10.6 min)的HPLC 制備分離圖Fig.3 Separation of MWZ2(10.6 min)by PITC-HPLC

2.4 結構鑒定

分離獲得的MWZ2 是衍生劑異硫氰酸苯酯(PITC)與銅藻樣品某一組分通過衍生反應生成的衍生物，其反應方程式如下。

MWZ2 為黃色固體粉末，IR (KBr)υ (cm-1):3436 (NH2)，3292 (COOH)，1564，1413，805 (Ph)，1022 (C = S);TOF-MS-ESI m/z(%):226.2804［M+H］+;1H-NMR (400 MHz，MeOD)δ:7.48～6.96(m，5H)，4.91 (m，1H)，2.94 (m，2H);13C NMR(100 MHz，MeOD)δ:176.0，130.4，129.6，126.5，125.1，57.8，39.2。結合核磁共振波譜、高分辨質譜、紅外光譜數據，最終推測MWZ 去掉已知取代基團PITC 后的成分為β-丙氨酸，它的分子式為C3H7NO2，分子量為89.09，其分子結構式如圖4。

圖4 β-丙氨酸Fig.4 β-Alanine

3 討論

目前，用于氨基酸分離純化的方法有沉淀法、膜分離法、萃取法以及離子交換法等，其中以離子交換法應用最為廣泛。該法根據氨基酸是兩性電解質這一特性，以及目的氨基酸與雜質氨基酸pK、pI 值的差異，利用離子交換樹脂對各種氨基酸吸附能力的不同進行分離純化［6］。本實驗采用Dowex 50W-X8型陽離子交換樹脂對銅藻游離氨基酸粗提樣品進行分離，收集高濃度氨水洗脫液，經檢測發(fā)現分離效果較好，含有多種氨基酸組分。

近些年來，隨著氨基酸的廣泛應用，用液相色譜法檢測氨基酸的分析水平也不斷提高，柱前衍生是先將氨基酸轉化成衍生物，再進行色譜分離的一種衍生方法，操作簡便、快速，靈敏度高，并在短時間內能分離20 多種氨基酸，針對各種衍生劑的研究與開發(fā)，目前應用廣泛的方法有異硫氰酸苯酯(PITC)法，鄰苯二甲醛-巰基乙醇(OPA)法，6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞胺基甲酸酯(AQC)法等［7］。PITCHPLC 法與其它柱前衍生法相比，其衍生過程簡便，衍生物齊全，而衍生物的高靈敏度、高穩(wěn)定性，使各種氨基酸含量的檢測結果更加準確可靠，不失為一種快速、準確、經濟的方法［8］，可廣泛應用于海洋藻類中非蛋白質氨基酸的檢測分析研究。但由于本實驗所用的氨基酸標準品(Sigma)僅為17 種常見蛋白氨基酸混合品，缺乏20 種常見氨基酸中的天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸，并不能判定另外兩種未知組分就一定是非蛋白質氨基酸，另還需考慮寡肽等的可能性，具體需進一步分離純化來確定，但因含量過低而未進行。

本研究從銅藻中發(fā)現β-丙氨酸組分并鑒定了其結構，它是自然界中唯一存在的β 型氨基酸［9］，其氨基位于碳鏈的β 位，與它常見的類似物左旋α-丙氨酸不同，它沒有手性中心。β-丙氨酸是一種重要的非蛋白質氨基酸，在生物體內，β-丙氨酸并不參與蛋白質或酶的合成，通常它由二氫尿嘧啶和肌肽的降解產生。β-丙氨酸也是自發(fā)生成的縮氨酸肌肽和維生素B5 的重要組分，在正常狀態(tài)下，β-丙氨酸被最終代謝為乙酸。β-丙氨酸是肌肽少有的幾個前體物質之一。已經證實，補充β-丙氨酸有助于提升肌肉組織內肌肽的含量，從而消除運動員疲勞，提升肌肉活動能力，但如果β-丙氨酸攝入量(以溶液或膠囊服用)超過10 mg 每千克體重，將誘發(fā)機體感覺異常［10］。銅藻資源豐富，我們的研究為更好的利用此藻提供了新的方向。

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