陳 慧，李雪虎，陸錫宏，楊賢鵬，梁劍平*

1中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所，蘭州730000;2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070

獨(dú)活(Radix Angelicae Pubescentis)為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸的干燥根［1］，主產(chǎn)于四川、湖北、安徽等地，是一種比較常見(jiàn)的中藥。主要有祛風(fēng)除濕、通痹止痛等功效。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，香豆素類化合物是獨(dú)活中所含的最主要活性成分，其中又以蛇床子素(Osthole)含量最高［2］，獨(dú)活具有抗炎鎮(zhèn)痛［3］、抗氧化［4］、抗血管生成作用［5］，其作用與蛇床子素成分密切相關(guān)。此外，還有揮發(fā)油、有機(jī)酸等［6］。獨(dú)活中蛇床子素由于具有較好的藥理活性受到了越來(lái)越多研究者的關(guān)注。目前，天然產(chǎn)物中有效成分的傳統(tǒng)提取方法有醇滲漉法、浸漬法、索氏抽提法和加熱回流法。但這些提取方法存在提取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑用量大、提取率低等問(wèn)題。近年來(lái)，現(xiàn)代提取技術(shù)超聲提取法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作時(shí)間短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于提取天然產(chǎn)物中揮發(fā)油、苷類多糖、生物堿等有效成分［7］。經(jīng)查閱，前人［8，9］多采用單因子或正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)無(wú)法找到最佳因素水平組合。目前還未見(jiàn)采用響應(yīng)面法超聲輔助提取獨(dú)活的報(bào)道，為此，本文以獨(dú)活為試驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)獨(dú)活超聲波輔助提取過(guò)程中液料比(浸提液體積與獨(dú)活質(zhì)量的比值)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間以及提取溫度等因素與蛇床子素得率關(guān)系的研究，結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)蛇床子素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選，旨在獲得最佳提取工藝，為獨(dú)活的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

獨(dú)活(西藏農(nóng)科院提供，由蘭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院王曉飛博士鑒定);乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙醇、氯仿、氨水、鹽酸;去離子水，本實(shí)驗(yàn)室自制;其余試劑均為分析純。蛇床子素(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

1.2 儀器

高效液相色譜儀，美國(guó)Waterse2695;DFT-250手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司;KH-300DB 型數(shù)控超聲清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;Pine-tree 純水機(jī)，北京湘順源科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent EclipseXDB-C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(60∶40)，等度洗脫;體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)322 nm;柱溫25 ℃;進(jìn)樣體積10 μL;HPLC 色譜圖如圖1 所示。

圖1 蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品(a)和樣品(b)的HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard (a)and sample (b)

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蛇床子素對(duì)照品7.4 mg，加甲醇制成含蛇床子素0.74 mg/mL 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取獨(dú)活干膏0.2 g，加入甲醇少量，超聲20 min 溶解后，放冷，濾過(guò)，置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蛇床子素對(duì)照品7.4 mg，加入甲醇使溶解并定容于10 mL 量瓶中，精確量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，于2 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻即得。用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)后，分別進(jìn)樣每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次，測(cè)定峰面積積分值。以蛇床子素質(zhì)量濃度對(duì)峰面積平均值進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y =4E +07X +85203(R2=0.9993)在74.00～444.00 μg 與峰面積呈良好線性相關(guān)。

2.5 提取工藝流程

獨(dú)活→洗凈烘干→粉碎過(guò)篩→加入提取劑→超聲提取→減壓濃縮回收提取劑→0.3%鹽酸溶液溶解→過(guò)濾(氨水調(diào)pH 為9-11)→氯仿萃取→甲醇定容→計(jì)算粗品中蛇床子素含量

2.6 浸提條件的選擇

研究溫度(40、50、60、70、80 ℃)，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)(55%、65%、75%、85%、95%)，料液比(10、15、20、25、30 mL/g)和提取時(shí)間(20、30、40、50、60 min)對(duì)獨(dú)活提取率的影響，首先做單因素實(shí)驗(yàn)考察以上條件對(duì)提取率的影響，然后采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化最佳工藝條件。試驗(yàn)均進(jìn)行三次，取平均值。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取溫度對(duì)獨(dú)活中蛇床子素提取率的影響

在體積分?jǐn)?shù)75%，提取時(shí)間為40 min，料液比為20 mL/g 的提取條件下，分別考察不同超聲溫度對(duì)蛇床子素提取，提取次數(shù)為3 次。超聲溫度對(duì)提取率的影響，如圖2 所示，隨著提取溫度的上升，蛇床子素提取率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，但溫度超過(guò)60℃，提取率反而下降。分析原因是:從較低溫度升至60 ℃，熱效率升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，利于蛇床子素的破壁溶出;但隨著溫度的繼續(xù)升高，使部分蛋白凝固從而不利于蛇床子素溶出，故提取率下降，因此選擇提取溫度為60 ℃左右較為合適。

圖2 提取溫度對(duì)蛇床子素提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on the yield of osthole

3.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)獨(dú)活中蛇床子素提取率的影響

在提取溫度60 ℃，超聲時(shí)間40 min，液料比20 mL/g 的提取條件下，分別用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)獨(dú)活進(jìn)行提取，提取次數(shù)為3 次。提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響，如圖3 所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，蛇床子素提取率先增大后減小。這是因?yàn)橐掖紝?duì)蛇床子素的溶解度比水大，乙醇對(duì)細(xì)胞的破壞作用比水強(qiáng)，在超聲波作用下表現(xiàn)得更加明顯。乙醇體積分?jǐn)?shù)在75%時(shí)，獨(dú)活中的蛇床子素提取率較高，考慮到乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)增加生產(chǎn)成本。因此選取75%乙醇作為提取溶劑。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蛇床子素提取率的影響Fig.3 Effect of percentage of ethanol on the yield of osthole

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)獨(dú)活中蛇床子素提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，液料比20 mL/g，提取溫度60 ℃的提取條件下，分別用不同的超聲時(shí)間對(duì)獨(dú)活進(jìn)行提取。提取時(shí)間對(duì)提取率的影響如圖4 所示由圖可知。隨著超聲作用時(shí)間的增加，獨(dú)活中蛇床子素的提取率迅速增大，可見(jiàn)提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取越充分。但時(shí)間超過(guò)40 min 后，蛇床子素提取率有所下降，因此選擇提取時(shí)間為40 min 左右較為合適。

圖4 提取時(shí)間對(duì)蛇床子素提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of osthole

3.1.4 料液比對(duì)獨(dú)活中蛇床子素提取率的影響

在提取溫度60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，超聲時(shí)間60 min 的提取條件下，分別用不同的料液比對(duì)獨(dú)活進(jìn)行提取。料液比對(duì)提取率的影響如圖5 可知，隨著溶劑量的增加，蛇床子素含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)料液比低于1∶20 時(shí)，提取率隨著料液比的增大而升高，這是因?yàn)樘崛÷实母叩团c蛇床子素向溶劑擴(kuò)散的難易程度有關(guān)，料液比小，溶劑量少，導(dǎo)致兩相界面間的濃度差小，不利于蛇床子素的擴(kuò)散。但當(dāng)料液比高于1∶20 時(shí)，提取率變化不明顯，而且成本增加，不利用工業(yè)生產(chǎn)，因此最佳提取料液比為1∶20。

圖5 水料比對(duì)蛇床子素提取率的影響Fig.5 Effect of solvent/material ratio on the yield of osthole

3.1.5 提取次數(shù)對(duì)獨(dú)活中蛇床子素提取率的影響

以超聲溫度60 ℃，75%乙醇為溶劑，1∶20 料液比，40 min 超聲時(shí)間作為條件考查不同提取次數(shù)對(duì)獨(dú)活中蛇床子素提取率的影響。如圖6 所示，隨著提取次數(shù)的增加提取率逐漸增大，在提取次數(shù)到大3 時(shí)，提取率趨于穩(wěn)定，但隨著提取次數(shù)的增加所耗費(fèi)的溶劑和成本也急劇增加，綜合各種因素考慮本試驗(yàn)選定提取3 次為宜，既減少后期濃縮的困難，又節(jié)省能耗。

圖6 提取次數(shù)對(duì)蛇床子素提取率的影響Fig.6 Effect of extraction times on the yield of osthole

3.2 四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.2.1 蛇床子素提取率回歸方程的建立與檢驗(yàn)

為了確定在多因素條件下超聲波提取蛇床子素的最佳工藝，本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇合適的參數(shù)范圍，對(duì)提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比4 個(gè)因素進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以蛇床子素的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化蛇床子素的最佳提取工藝，試驗(yàn)自變量因素編碼及水平見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表及編碼Table 1 Code and level of factors chosen for the trials

利用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and experimental result of research surface methodology

2500000.959 2700000.978 2800000.985 2900000.987 3000000.969

根據(jù)表2 的結(jié)果，應(yīng)用Design-Expert 7.0.0 軟件進(jìn)行編程計(jì)算，通過(guò)其響應(yīng)面回歸(RSREG)程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出回歸模型，回歸方程為:Y=0.98+ 0.019X1-0.0017X2+ 0.023X3+ 0.016X4-0.011X1X2-0. 00288X1X3-0. 00338X1X4-0.00388X2X3-0. 014X2X4-0.013X3X4-0.02X-0.03X-0.02X-0.037X。

表3 回歸模型統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 3 Results of statistical analysis for regression coefficients of model

由表3 回歸方差顯著性檢驗(yàn)表明，一次項(xiàng)超聲提取溫度、時(shí)間對(duì)蛇床子素得率的線性效應(yīng)極顯著，料液比對(duì)蛇床子素得率的線性效應(yīng)顯著;二次項(xiàng)超聲提取溫度、乙醇濃度、時(shí)間、料液比對(duì)蛇床子素提取率的曲面效應(yīng)極顯著;比較各因子間交互作用不顯著。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)回歸方程顯著性檢測(cè)P=0.01，極顯著，模型的確定系數(shù)為0.8981，說(shuō)明該模型能解釋89.81%響應(yīng)值的變化，即該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小，回歸方程失擬檢驗(yàn)不顯著，表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。在本實(shí)驗(yàn)中溫度和時(shí)間是影響蛇床子素提取最重要的兩個(gè)因素，在適當(dāng)?shù)臏囟群蜁r(shí)間的條件下，提取蛇床子素能達(dá)到最大值，且X1(溫度)＞X3(時(shí)間)＞X4(料液比)＞X2(乙醇體積分?jǐn)?shù));同時(shí)可以看出，各因素交互作用都不顯著。通過(guò)得出的模型，得到的最優(yōu)條件。最優(yōu)條件下即提取溫度為64.63 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為73.18%，提取時(shí)間為45.33 min，料液比為20.67 mL/g。

3.2.2 響應(yīng)面分析

圖7 是通過(guò)多元回歸方程所做的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，所擬合的響應(yīng)曲面和等高線圖能比較直觀地反映各因素和各因素間的交互作用。等高線圖直觀地反映出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，橢圓形反映了兩因素的交互作用較強(qiáng)，而圓形則相反，由圖7 可以看出，6 個(gè)響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，隨著每個(gè)因素的增大，響應(yīng)值增大;當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小;比較6 組圖及數(shù)據(jù)可得出X1、X2、X3、X4及各因素之間的交互作用對(duì)蛇床子素提取率的影響。從圖7a 中可以看出，固定提取時(shí)間40 min、液料比20 mL/g 的水平下，蛇床子素含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)及提取溫度的加大而急劇增加，表現(xiàn)為等高線更為陡峭;且乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蛇床子素含量的影響較提取時(shí)間明顯。而當(dāng)體積分?jǐn)?shù)超過(guò)75%，提取溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，蛇床子素含量增加變緩，等高線形狀逐漸向橢圓形發(fā)展，這說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度之間有較強(qiáng)的交互作用。從圖7b 可以看出，固定體積分?jǐn)?shù)75%、液料比20 mL/g 的水平下，開始蛇床子素隨著提取時(shí)間與提取溫度的增加而增加，但當(dāng)提取溫度超過(guò)60 ℃，提取時(shí)間超45 min 后，蛇床子素含量增加緩慢，而且等高線也逐漸呈現(xiàn)橢圓形狀，這說(shuō)明在蛇床子素含量緩慢達(dá)到最高值后仍有下降趨勢(shì)。這充分表明提取時(shí)間與提取溫度兩個(gè)因素的有一定交互作用。從圖7c 中可看出，等高線呈現(xiàn)明顯橢圓形，這表明在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取時(shí)間45 min 水平下，蛇床子素含量隨著提取溫度及料液比的加大而急劇增加，表現(xiàn)為等高線更為陡峭;料液比對(duì)蛇床子素含量的影響較提取溫度明顯。這說(shuō)明料液比與提取溫度之間有較強(qiáng)的交互作用。從圖7 d 中看出，等高線呈現(xiàn)橢圓形不是很明顯，在固定提取溫度60 ℃、液料比20 mL/g 的水平下，蛇床子素含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)和乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增加，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)45 min，同時(shí)乙醇的體積分?jǐn)?shù)超過(guò)75%后。等高線變化比較平滑，可知提取時(shí)間與體積分?jǐn)?shù)的交互作用不明顯。從圖7e 中可以看出，當(dāng)固定提取時(shí)間45 min、提取溫度60 ℃水平下，蛇床子素含量隨著液料比的增大而先增加，然后又有降低的趨勢(shì)，從而表現(xiàn)為單位時(shí)間內(nèi)蛇床子素含量相對(duì)下降。另等高線形狀也逐漸呈現(xiàn)橢圓形狀，變化比較陡，得知體積分?jǐn)?shù)和液料比之間有顯著性交互作用。圖7f 中的等高線形狀呈圓形，提取時(shí)間與液料比的有著顯著的交互作用。通過(guò)響應(yīng)曲面交互作用分析，可發(fā)現(xiàn)各因素之間的交互作用對(duì)蛇床子素含量有重要影響。

3.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

結(jié)合實(shí)際操作，把最優(yōu)條件調(diào)整為溫度為65℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取時(shí)間為45 min，料液比為20 mL/g。并在此調(diào)整的最優(yōu)條件下平行提取3次，得到提取率分別為0.964%、0.978%、0.986%取平均值0.976%。經(jīng)測(cè)定，此值與理論值的誤差為0.011%，即RSD =0.011%，說(shuō)明模型能較好的預(yù)測(cè)實(shí)際提取率。

4 討論

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛇床子素的提取率的趨勢(shì)隨著提取溫度升高，乙醇濃度的增大，提取時(shí)間延長(zhǎng)及料液比升高的增大而增大;而隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)及料液比的增加，蛇床子素提取率的趨勢(shì)是先增大后減小;提取次數(shù)為3 次時(shí)，獨(dú)活中的蛇床子素幾乎可以被提取完全。

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度、時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有極顯著的影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，而料液比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著;得到的回歸方程Y=0.98+0.019X1-0.0017X2+0.023X3+0.016X4-0.011X1X2-0.00288X1X3-0.00338X1X4-0.00388X2X3-0.014X2X4-0.013X3X4-0.02X-0.03X22-0.02X-0.037X

圖7 因素之間的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.7 RSM and contour line plots between different experimental factors

應(yīng)用響應(yīng)面分析法，確定超聲提取蛇床子素的最優(yōu)條件為:提取溫度64.63 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為73.18%，提取時(shí)間45.33 min，料液比為20.67 mL/g;但從實(shí)際的操作考慮，調(diào)整為提取溫度為65 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，提取時(shí)間為45 min，料液比為20 mL/g。用上述實(shí)際的最佳條件進(jìn)行提取，測(cè)得蛇床子素的提取率為0. 976%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差RSD=0.011%，所建立的模型能較好的預(yù)測(cè)超聲提取的實(shí)際提取率。

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