曾高峰 ，張志勇，魯 力，肖德強(qiáng)，宗少暉，何建明

1廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院;2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科;3 廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，南寧530021

據(jù)統(tǒng)計，我國約有1.6 億老年人，人口老齡化是目前較嚴(yán)峻的社會公共問題。同時也使得醫(yī)療行業(yè)面對諸多老年疾病，其中，怎樣攻克老年癡呆是急需解決的問題之一。本研究通過觀察生姜提取物對AD 大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、CAT 及MDA 水平的影響，探討其對AD 的治療作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康SD 大鼠(雌雄各半)60 只，體重210～280 g，平均240 ± 16.7 g。購于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，本實驗研究符合廣西醫(yī)科大學(xué)動物保護(hù)委員會標(biāo)準(zhǔn)要求，實驗中盡可能減少動物使用數(shù)量和減輕動物痛苦。動物予適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 試劑

生姜提取物:含量為5%姜辣素［6-姜辣醇(6-Gingerol)、6-生姜酚(6-Shogaol)、8-姜辣醇(8-Gingerol)、10-姜辣醇(10-Gingerol)］，其中6-姜辣醇(6-Gingerol)為主要成分。由上海靈菱食用菌科技有限公司提供。

β 淀粉樣蛋白:Aβ25-35(批號:050M4764)250 μg(美國Sigma 公司)加入無菌生理鹽水，制成1 g/L 的溶液，保持在37 ℃恒溫箱孵育3 d，使其老化并成為聚集態(tài)的Aβ25-35。

超氧化物歧化酶(SOD)一抗、過氧化氫酶(CAT)一抗、大鼠丙二醛(MDA)elisa 檢測試劑盒:均由北京博奧森生物技術(shù)有限公式提供。

1.3 主要儀器

SR-5R 型腦立體定位儀(日本成茂公司);微量注射器(上海醫(yī)用激光儀器廠);MK3 型酶標(biāo)儀(美國Thermo 公司);光學(xué)顯微鏡(XSP-12C，上海永亨光學(xué)制造有限公司);病理圖像分析儀(DMR +Q550，德國LEICA 公司)。

1.4 實驗方法

將大鼠用10%水合氯醛(0.5 μL/g)麻醉，固定于腦立體定位儀上，對耳線跟上頜骨三角固定，保持頭蓋骨水平。剪去頭頂部毛發(fā)，碘酊消毒并75%酒精脫碘后切開皮膚，參考Paxinos＆Watson 的方法選取大鼠側(cè)腦室［1］，于前囟向后0. 8 mm，中線旁開1.4 mm 處，三棱針鉆開顱骨，暴露硬腦膜，再用微量注射器緩慢自腦表面垂直進(jìn)針3.6 mm，將Aβ25-35緩慢注入5 μL(約10 min)，假手術(shù)組側(cè)腦室注射等量無菌生理鹽水，留針10 min 后緩慢撤針，撒些許青霉素粉后，縫合切口，并用碘伏消毒切口。單籠單只飼養(yǎng)待全部大鼠完全清醒并恢復(fù)活動。

術(shù)后應(yīng)用抗菌素，連續(xù)三天肌注青霉素10 萬單位/次，2 次/日和慶大霉素1000 單位/次，2 次/日(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供)。

1.5 氯化鋁灌胃

待全部大鼠完全清醒并恢復(fù)活動并術(shù)后愈合后，每日予3%氯化鋁100 mg/kg 灌胃。持續(xù)30 d。

1.6 用藥階段

生姜低劑量、中劑量、高劑量組分別予劑量為1、2、4 g/kg 生姜醇提取物，每只大鼠每日劑量以生理鹽水兌至5 mL，分兩次灌胃;石杉堿甲組予石杉堿甲片200 μg/kg，磨碎后兌生理鹽水至每只大鼠5 mL，分兩次灌胃;空白對照組每只大鼠予生理鹽水5 mL，分兩次灌胃;假手術(shù)組不予處理。灌胃用藥持續(xù)28 d。

1.7 組織取材及免疫組織化學(xué)染色及檢測IOD

將大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，取血后快速開胸，將針尖磨平的20 mL 注射器針經(jīng)左心室心尖穿刺達(dá)到主動脈插管，并血管鉗夾固定針，以500 mL 冷生理鹽水快速沖洗直至流出澄清液，以4%多聚甲醛400 mL 灌注固定，維持約60 min。待雙上肢硬化后除去顱蓋骨，取出完整的大腦組織，用上述固定液固定24 h 后，取大腦后1/3 海馬區(qū)豐富為標(biāo)本，常規(guī)脫水，石蠟包埋，作連續(xù)冠狀切片，片厚4～5 μm。常規(guī)脫蠟。

采用SP 法免疫組織化學(xué)法檢測大鼠大腦中SOD 及CAT 的表達(dá)水平。SOD 一抗工作濃度為1∶400，CAT 一抗工作濃度1∶400。光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，陽性細(xì)胞呈棕褐色或棕黃色。每張切片于400 倍鏡下取10 個不同視野，采用病理圖像分析儀及Leica QWIN 圖像分析軟件相結(jié)合分析同期制作的免疫組化切片，并根據(jù)圖像的染色情況定下一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)此測定出大鼠大腦中SOD 及CAT 的積分光密度(IOD)值，IOD 值與SOD 及CAT的活性呈正相關(guān)，即IOD 值越大，相應(yīng)的SOD 及CAT 的活性越高，IOD 值越小，相應(yīng)的指標(biāo)活性也越低。

1.8 丙二醛(MDA)檢測

大鼠常規(guī)心臟取血1.0～2.0 mL，加入到抗凝EB 管中室溫靜置4 h 后以5000 rpm 離心20 min 后取血清，置于-80 ℃冰箱中保存待用。MDA 采用elisa 分析方法，按照說明書步驟操作，數(shù)據(jù)在取450 nm 酶標(biāo)儀上于15 min 內(nèi)讀取，后通過標(biāo)準(zhǔn)品制成的濃度曲線公式計算出MDA 濃度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)均采用x ± s 表示，采用方差分析(one-way ANOVA 法)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠大腦海馬區(qū)SOD 及CAT 的表達(dá)

400 倍鏡下，生姜高劑量組、石杉堿甲組、較生姜中劑量和低劑量、空白對照組陽性細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目及層數(shù)多，神經(jīng)元細(xì)胞排列較整齊，神經(jīng)元細(xì)胞較大，胞質(zhì)多;細(xì)胞核固縮，膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元纖維纏結(jié)少。生姜高劑量組與石杉堿甲組無明顯差別;生姜中劑量、低劑量及空白對照組間無明顯差別。SOD、CAT 積分光密度統(tǒng)計學(xué)分析:OP + HG組、OP + HupA 組較OP + LG 組和OP + MG 組、OP 組大腦組織中SOD、CAT 積分光密度明顯增高(P ＜0.05)，生姜高劑量組與石杉堿甲組無明顯差別(P ＞0.05)，生姜中劑量組、低劑量組及空白對照組間無明顯差別(P ＞0.05)。見表2。

2.2 大鼠大腦海馬區(qū)MDA 的表達(dá)

丙二醛(MDA)elisa 分析表明，生姜高劑量組、石杉堿甲組較生姜中劑量和低劑量、空白對照組血清中MDA 水平明顯升高(P ＜0.05)。見表1。生姜高劑量組與石杉堿甲組無明顯差別(P ＞0.05)，生姜中劑量組、低劑量組及空白對照組間無明顯差別(P ＞0.05)。

表1 MDA 血清濃度(Elisa 分析法)(±s)Table 1 Serum concentrations of MDA (Elisa analysis)(±s)

表1 MDA 血清濃度(Elisa 分析法)(±s)Table 1 Serum concentrations of MDA (Elisa analysis)(±s)

注:a.與OP + LG 組比較，P ＜0.05;b.與OP + MG 組比較，P ＜0.05;c.與OP + HG 組比較，P ＜0.05;d.與SHAM 組比較，P ＜0.05;e.與OP + HupA 組比較，P ＜0.05;f.與OP 組比較，P ＜0.05。Note:a.Compare with OP + LG，P ＜0.05;b.Compare with OP + MG，P ＜0.05;c.Compare with OP + HG，P ＜0.05;d.Compare with SHAM，P＜0.05;e.Compare with OP + HupA，P ＜0.05;f.Compare with OP，P ＜0.05.

組別GroupnMDA(nmol/mL)生姜提取物低劑量組OP + LG104.27 ±2.19cde生姜提取物中劑量組OP + MG104.91 ±2.45cde生姜提取物高劑量組OP + HG103.34 ±1.20abf假手術(shù)組SHAM82.25 ±1.12abf石杉堿甲組OP + HupA102.65 ±1.09abf空白對照組OP75.80 ±2.52cde

表2 大鼠大腦中SOD 及CAT 積分光密度(IOD)結(jié)果(±s)Table 2 Integral optical density (IOD)of SOD and CAT in rat brain (±s)

表2 大鼠大腦中SOD 及CAT 積分光密度(IOD)結(jié)果(±s)Table 2 Integral optical density (IOD)of SOD and CAT in rat brain (±s)

注:a 與OP + LG 組比較，P ＜0.05;b 與OP + MG 組比較，P ＜0.05;c 與OP + HG 組比較，P ＜0.05;d 與SHAM 組比較，P ＜0.05;e 與OP + HupA 組比較，P ＜0.05;f 與OP 組比較，P ＜0.05Note:a.Compare with OP + LG，P ＜0.05;b.Compare with OP + MG，P ＜0.05;c.Compare with OP + HG， P ＜0.05;d.Compare with SHAM，P ＜0.05;e.Compare with OP + HupA，P ＜0.05;f.Compare with OP， P ＜0.05

組別GroupnSOD(IOD)CAT(IOD)生姜提取物低劑量組OP + LG10178.31 ±10.95cde231.86 ±12.44cde生姜提取物中劑量組OP + MG10190.85 ±14.46cde241.31 ±13.49cde生姜提取物高劑量組OP + HG10248.74 ±16.41abf263.73 ±17.18abf假手術(shù)組SHAM8262.31 ±18.50abf304.10 ±18.04abf石杉堿甲組OP + HupA10250.99 ±17.11abf291.21 ±18.23abf空白對照組OP7170.22 ±12.12cde218.74 ±14.48cde

3 討論

AD 即老年癡呆癥，是種進(jìn)行性發(fā)展的致死性的神經(jīng)退行性的疾病。目前臨床上對AD 缺乏有效的治療手段，這是由于AD 不清晰的病因及復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制所致［2］。有研究表明，大腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了AD 的發(fā)生和發(fā)展［3］。因此，對AD治療的研究是擺在醫(yī)療工作者面前的一個難題。生姜屬于多年生宿根草本植物。其塊莖中含有多種成分，其中有姜辣素、姜精油、姜酚及黃酮等，還含有多種微量元素［4］。生姜味辛性溫，具有溫中止嘔、解表散寒及抗氧化抗癌等功效［5］。除此之外，生姜還具有很多功能有待我們發(fā)現(xiàn)。本研究采用側(cè)腦室注射Aβ25-35 及氯化鋁溶液灌胃，觀察其對β-淀粉樣蛋白致AD 大鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響，并進(jìn)一步探討生姜提取物對AD 的療效及其可能的作用機(jī)制，為生姜提取物臨床治療AD 提供一定的實驗依據(jù)。

德國醫(yī)生Alois Alzheime(1864～1915)于90年前首先對AD 進(jìn)行描述，90 年里人們對AD 的研究取得了很大的進(jìn)展，但發(fā)病機(jī)制至今未明，主要是原因是確切的病因和病理生理過程十分復(fù)雜，其主要的病理表現(xiàn)是腦內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(主要成分是過磷酸化tau 蛋白)和老年斑(主要成分是β 淀粉樣多肽，即Aβ)［6］。Aβ 具有神經(jīng)毒性作用，能直接引起神經(jīng)元的死亡和誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡都已被證實［7］，Aβ 是AD 形成并發(fā)展的主要因素。因此本研究以Aβ 和氯化鋁雙干預(yù)建立AD 大鼠模型［8］。關(guān)于AD 的發(fā)病機(jī)制，目前比較認(rèn)可的假說為氧化應(yīng)激假說、能量代謝假說、amyloid 級聯(lián)反應(yīng)假說以及膽堿能假說等［9］。氧化應(yīng)激的定義是指氧化物超過了機(jī)體內(nèi)源性的抗氧化能力從而引起機(jī)體組織的分子氧化，并造成組織損傷。氧化應(yīng)激假說能一定程度上解釋AD 病理改變和認(rèn)知及記憶功能的改變［10］。說明氧化應(yīng)激是AD 主要病因之一，而氧化應(yīng)激在一定程度上可以說是貫通于其他幾種假說。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)能有效地清除體內(nèi)氧自由基，SOD 及CAT 的活性高低決定了機(jī)體清除氧自由基能力的大小。丙二醛(MDA)為多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產(chǎn)物，是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，機(jī)體內(nèi)MDA 水平能反應(yīng)出機(jī)體氧化應(yīng)激的程度。

本研究顯示，生姜提取物干預(yù)的OP + HG 組、OP + MG 組、OP + LG 組AD 大鼠大腦SOD、CAT的陽性表達(dá)活性較OP 組都有不同程度的升高，MDA 水平下降，但僅OP + HG 組差異性顯著(P ＜0.05)，OP + MG 組、OP + LG 組差異不顯著(P ＞0.05)。

SHAM 組及OP + HupA 組較OP 組SOD、CAT陽性表達(dá)明顯升高(P ＞0.05)，MDA 水平明顯降低(P ＞0.05)。在一定程度上說明側(cè)腦室穿刺術(shù)對本實驗影響較小，也說明了Aβ25-35 干預(yù)能較好地建立AD 大鼠模型。

綜上所述，生姜提取物在高劑量時能夠提高AD 大鼠大腦中SOD、CAT 陽性表達(dá)，并能降低MDA水平，即生姜提取物能在一定程度上改善阿爾茨海默病(AD)氧化應(yīng)激反應(yīng)。但生姜提取物是通過清除氧自由基還是提高相關(guān)酶的活性，抑或是兩者都兼?zhèn)?，目前還不明了，其具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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