吳偉斌，龐建新，曹 瑩，謝寶平，丘玉昌

南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院新藥評(píng)價(jià)中心，廣州510515

近年來的研究表明，NO 引起的氧化應(yīng)激損傷是引起糖尿病的重要環(huán)節(jié)［1］，相對(duì)于機(jī)體其他組織細(xì)胞，胰島β 細(xì)胞更容易受到NO 的攻擊，導(dǎo)致功能缺陷［2］。因此，阻斷NO 引起的胰島細(xì)胞損傷，成為防治糖尿病的重要途徑。

石參(Urariacrinita)是豆科(Leguminosae)植物貓尾射(Uraria crinite Desv.)的干燥根，據(jù)《廣西中藥志》記載，其味甘，氣香，性溫?zé)o毒;有行氣止痛，逐飲化痰，治心胃氣痛，痰飲咳嗽之功效［3］。以往對(duì)于石參藥理作用的研究少有報(bào)道。我們前期研究表明，石參的提取液具有降低II 型糖尿病小鼠的空腹血糖、改善糖耐量、促進(jìn)胰島素分泌的作用［4］;來源于石參的總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力［5］。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用SNP 作為NO 供體，觀察石參總黃酮對(duì)NO 引起的胰島β 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并探討可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)利用石參打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 石參總黃酮的制備

石參總黃酮的制備參見文獻(xiàn)［5］。

1.2 細(xì)胞

大鼠胰島β 細(xì)胞株RIN-m，購(gòu)自美國(guó)ATCC。

1.3 試劑

1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Hyclone);胎牛血清(FBS)(杭州四季青);青鏈霉素(北京吉諾);3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(sigma);硝普鈉(Sodium Nitroprusside，SNP)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);DMSO(廣州化學(xué)試劑廠);總谷胱甘肽、總SOD 活性、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.4 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo);恒溫水浴箱(上海一恒);恒溫培養(yǎng)箱(Shel Lab);高速低溫離心機(jī)(Sigma);連續(xù)波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)(Bio-Rad);

1.5 RIN-m 細(xì)胞SNP 損傷模型的構(gòu)建

RIN-m 細(xì)胞用含10%FBS、1%青鏈霉素的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按1 ×104/孔的細(xì)胞量鋪入96 孔板中，培養(yǎng)過夜后，加入不同濃度的SNP(5、8、10、15、20 mmol/L)，分別培養(yǎng)3 h 和4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 的新鮮培養(yǎng)基和10 μL 的含5 mg/mL MTT 的PBS 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO100 μL，于570 nm 波長(zhǎng)處讀數(shù)。每組3 個(gè)復(fù)孔。

1.6 石參總黃酮對(duì)細(xì)胞活力的影響

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RIN-m 細(xì)胞按1 ×104/孔的細(xì)胞量鋪入96 孔板中。把含有梯度濃度的石參總黃酮的完全培養(yǎng)基加入孔板，培養(yǎng)4 h 后，更換培養(yǎng)基為含10 mmol/LSNP 的完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)3 h 后，吸棄培養(yǎng)基，及后每孔加入100 μL 的新鮮培養(yǎng)基和10 μL 的含5 mg/mL MTT 的PBS 溶液;培養(yǎng)4 h 后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO100 μL，于570 nm 波長(zhǎng)處讀數(shù)。實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、給藥組(分別含石參總黃酮0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL)。每組3 個(gè)復(fù)孔。

1.7 石參總黃酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)MAD 含量和總SOD 活性的影響

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RIN-m 細(xì)胞按1 ×104/孔的細(xì)胞量鋪入96 孔板中。把含有梯度濃度的石參總黃酮的完全培養(yǎng)基加入孔板，培養(yǎng)4 h 后，更換培養(yǎng)基為含10 mmol/L SNP 的完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)3 h 后，吸棄上清，孔板置于冰上，以預(yù)冷的PBS 蕩洗細(xì)胞兩次，完全吸去PBS 后，每孔加入細(xì)胞裂解液200 μL，冰浴中裂解90 min，后用低溫高速離心機(jī)4 ℃下以1600 g 離心10 min，取上清。按照試劑盒的步驟檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)的含量和總SOD 活性。實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、給藥組(分別含石參總黃酮0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL)。每組3 個(gè)復(fù)孔。

1.8 石參總黃酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量的影響

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RIN-m 細(xì)胞按1 ×104/孔的細(xì)胞量鋪入96 孔板中。把含有梯度濃度的石參總黃酮的完全培養(yǎng)基加入孔板，培養(yǎng)4 h 后，更換培養(yǎng)基為含10 mmol/L SNP 的完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)3 h 后，吸棄上清，孔板置于冰上，以預(yù)冷的PBS 蕩洗細(xì)胞兩次，完全吸去PBS 后，按試劑盒要求，每孔加入蛋白去除試劑S100 μL，冰浴中用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，收集于EP 管中，并在液氮和37 ℃溫水中進(jìn)行兩次反復(fù)凍融。然后用低溫高速離心機(jī)4 ℃下以10000 g 離心10 min，取上清，按試劑盒步驟檢測(cè)總谷胱甘肽的含量。實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、給藥組(分別含石參總黃酮0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL)。每組3 個(gè)復(fù)孔。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以mean ±SD 表示，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，使用LSD 進(jìn)行組間的兩兩比較，P ＜0.05 視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 RIN-m 細(xì)胞SNP 損傷模型的構(gòu)建

SNP 是外源性NO 供體，在培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)變?yōu)镹O而損傷細(xì)胞。如圖1 所示，不同濃度的SNP 作用于RIN-m 細(xì)胞后，均使OD 值明顯下降，表明細(xì)胞受到NO 的損傷。其中10 mMSNP 作用3 h，使細(xì)胞活力下降約50%(與空白對(duì)照比)，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10mMSNP 作用3 h 構(gòu)建損傷模型。

2.2 石參總黃酮對(duì)細(xì)胞活力的影響

圖2 顯示，石參總黃酮在0.05～0.3 mg/mL 范圍內(nèi)，能顯著提高細(xì)胞的活性(P ＜0.05)，表明石參總黃酮對(duì)受SNP 損傷的RIN-m 細(xì)胞具有保護(hù)作用，并呈一定的濃度依賴性(方差不齊)。

2.3 石參總黃酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)MAD 含量的影響

從圖3 可以看出，受NO 損傷后，細(xì)胞內(nèi)MAD含量明顯升高，石參總黃酮在0.05～0.3 mg/mL 范圍內(nèi)，明顯降低損傷細(xì)胞內(nèi)MAD 含量，表明石參總黃酮能減輕NO 所致的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度。

圖3 石參總黃酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDA 含量的影響Fig.3 Effect of UCRFs on intracellular MDA content

2.4 石參總黃酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)總SOD 活性的影響

圖4 顯示，受NO 損傷后，細(xì)胞內(nèi)總SOD 活性明顯下降，石參總黃酮在0.05mg/mL～0.3mg/mL 范圍內(nèi)，明顯提高損傷細(xì)胞內(nèi)總SOD 活性(P ＜0.05)，并呈一定的濃度依賴性。

圖4 石參總黃酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD 活性的影響Fig.4 Effects of UCRFs on intracellular SOD activity

2.5 石參總黃酮對(duì)損傷細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量的影響

從圖5 可以看出，受NO 損傷后，細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量明顯下降，石參總黃酮在0.1 mg/mL～0.3 mg/mL 范圍內(nèi)，顯著提高損傷細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量(P ＜0.05)。

圖5 石參總黃酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽濃度的影響Fig.5 Effects of UCRFs on intracellular total GSH content

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，我們用SNP 作為NO 的外源性供體加入到培養(yǎng)體系，造成NO 對(duì)胰島β 細(xì)胞的損傷。一氧化氮(NO)是一種弱自由基，通過多種途徑參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程。NO 可直接抑制細(xì)胞線粒體的能量代謝，損傷DNA，導(dǎo)致胰島細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死［6］;此外，NO 還可以與活性氧類中間產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，生成過氧亞硝酸鹽陰離子(OONO-)等活性氮(reactive nitrogen species，RNS)和(或)活性氧類(reactive oxygen species，ROS)物質(zhì)，進(jìn)而損傷細(xì)胞［7，8］，最終導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞功能障礙。

本實(shí)驗(yàn)中，石參總黃酮能明顯提高SNP 損傷后細(xì)胞的活力，降低細(xì)胞MAD 含量，表明石參總黃酮對(duì)受NO 損傷的RIN-m 細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用。GSH 和SOD 是細(xì)胞內(nèi)自身存在的重要的對(duì)抗NO損傷的物質(zhì)。GSH 可清除細(xì)胞內(nèi)親電基團(tuán)，調(diào)節(jié)NO 平衡［9］;SOD 主要清除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的超氧陰離子，在減少過氧亞硝酸根生成的過程中起主要作用［10］。給予石參總黃酮后，細(xì)胞內(nèi)GSH 含量和SOD 的活性均顯著性上升，提示石參總黃酮可能通過提高RIN-m 細(xì)胞自身的抗氧化能力來抵抗NO 引起的損傷。

以上結(jié)果顯示，石參總黃酮對(duì)NO 所致的胰島細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用，具有一定的開發(fā)價(jià)值。

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