陳玉涵 李榮娜 王紅霞 曾翔俊 郝 剛▲

1.首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院消化科，北京 100069；2.河北秦皇島市第三醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北秦皇島 066001；

3.首都醫(yī)科大學，北京 100069

1988 年，Reaven 首次提出X 綜合征又稱為胰島素抵抗綜合征或代謝綜合征（metabolic syndrome，MS），包括胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、高胰島素血癥、 脂質(zhì)代謝紊亂以及高血壓等綜合的病理變化[1]。MS 是多基因和多種環(huán)境因素綜合作用所致的疾病，患病率逐年上升，已成為當前社會嚴重威脅人民健康的公共衛(wèi)生問題。 研究發(fā)現(xiàn)，機體可以內(nèi)源性產(chǎn)生硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）并完成一定的生理功能。生理濃度的H2S 與氣體分子一氧化氮、一氧化碳在部分生物學功能方面相同或相似，因此，它被看作體內(nèi)第三種的氣體信號分子。 H2S 是以L-半胱氨酸為底物，在胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶 （cystathionine-γ-lyase，CSE）的作用下產(chǎn)生，廣泛參與諸多的疾病的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸[2]。研究表明， 外源性H2S 治療可減輕高糖引起的ROS 產(chǎn)物的級聯(lián)反應，減輕DNA 的損傷[3]，外源性H2S 能抑制高濃度葡萄糖引起的心肌細胞損傷[4]，可以抑制胰島素分泌和成熟脂肪細胞對葡萄糖的攝取[5]。 筆者前期研究工作也發(fā)現(xiàn)，MS 小鼠內(nèi)源性H2S/CSE 體系受到嚴重抑制，因此推斷H2S 參與了MS 小鼠血糖和胰島素水平的調(diào)節(jié)。

基于以上問題，本實驗選用KK/Upj-Ay/J 小鼠作為MS 小鼠動物模型， 觀察H2S 供體NaHS 對血糖和血胰島素水平的影響，以及NaHS 對C2C12 骨骼肌細胞葡萄糖攝取能力的影響，并通過觀察NaHS 對小鼠胰島瘤細胞（NIT-1 細胞）胰島素分泌的影響，對機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞

MS 模型雄性KK/Upj-Ay/J 小鼠（8～10 周）由中科院動物所提供（動物質(zhì)量合格證號：SCKK2004-0001）；正常對照雄性C57BL/6J 小鼠（8～10 周）由中科院動物所提供（動物質(zhì)量合格證號：SCKK2005-0013）；小鼠胰島瘤（NIT-1）細胞由首都醫(yī)科大學病理生理教研室贈予；小鼠C2C12 骨骼肌細胞株購自上海中科院細胞庫。

1.2 試劑

硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）購自美國Sigma 公司；2-脫氧熒光葡萄糖（2-NBDG，2-[N-（7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazo l- 4- yl）amino]-2-deoxy-D-glucose） 購自Invitrogen 公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 8～10 周的雄性KK/Upj-Ay/J 小鼠隨機分為MS+NaHS 組和MS 組，每組各6 只。MS+NaHS組每日每只腹腔注射0.25 mL H2S 供體NaHS（78 μmol/kg）；MS 組每日每只注射等量生理鹽水。 取同周齡健康雄性C57BL/6J 小鼠10 只作為正常對照組（CON 組），注射等量生理鹽水。 連續(xù)給藥4 周。

1.3.2 空腹血糖和胰島素的測定 小鼠尾尖取血，強生ONE TOUCH Ultra 血糖儀測定血糖值。胰島素測定由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所采用放射免疫分析法完成。

1.3.3 肥胖指標和血脂的測定 取材前腹腔注射4%水合氯醛麻醉（0.8 mL/100 g），測量體重、腹圍和體長并計算Lee 指數(shù)。 體長即小鼠麻醉后仰臥，從鼻尖到肛門的長度。Lee's 指數(shù)=[體質(zhì)量（g）]1/3/體長（cm）×1000。取腎周、 腸系膜、 附睪處脂肪稱重并計算脂肪系數(shù)（VFC）。 VFC （%）=內(nèi)臟脂肪濕重（viceral fat mass，VFM）/體重（BW）。做頸總動脈插管取血，EDTA 抗凝，1500 r/min 離心10 min， 取上清液分裝入凍存管中，-80℃保存，全自動生化分析儀測定血脂各項指標。

1.3.4 2-NBDG 攝取實驗[6]將小鼠C2C12 骨骼肌細胞株采用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)， 于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)95%空氣5% CO237℃恒溫培養(yǎng)，取同批單層培養(yǎng)細胞吸去原培養(yǎng)液后，用無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，換用含5%新生牛血清的培養(yǎng)基， 取同批單層培養(yǎng)細胞分為A、B、C、D、E 5 組， 分別加入不同濃度的NaHS（0、50、100、200、400 mmol/L），培養(yǎng)1 h 后，棄去培養(yǎng)液，0.01 mol/L PBS 沖洗3 遍， 加入200 μmol/L 2-N BDG 培養(yǎng)20 min 后，棄去2- NBDG 液，0.01 mol/L PBS 沖洗3 遍，將玻片小心取出，放置在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長540 nm，可觀察到細胞內(nèi)有綠色熒光。各濃度NaHS 組選3 個皿，每皿隨機選取6個視野拍照，實驗重復3 次，用Imagepro Plus 6.0 軟件對熒光積分光密度（IA）進行統(tǒng)計分析。

1.3.5 小鼠NIT-1 細胞胰島素分泌功能的測定[7]采用DMEM 培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)95%空氣5%CO237℃恒溫培養(yǎng)。 取同批單層培養(yǎng)細胞分別加入不同濃度NaHS（0、50、100、200、400 mmol/L），培養(yǎng)1 h 后棄去培養(yǎng)液， 用含5.6 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 留取培養(yǎng)液，-20℃貯存，待測胰島素含量。 然后行葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗，每個皿棄去培養(yǎng)液后加入含16.7 mmol/L 葡萄糖的KRBB 液刺激1 h后，留取培養(yǎng)液，待測胰島素含量。

1.3.6 MS 診斷標準 采用2005 年4 月國際糖尿病聯(lián)盟（International Dabetes Federation，IDF）頒 布 的MS國際統(tǒng)一診斷標準，即在中心性肥胖基礎上具備以下4 項中的任何2 項：三酰甘油水平升高，高密度脂蛋白膽固醇水平降低，血壓升高，空腹血糖升高[8]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析， 計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MS 模型的評價

與CON 組小鼠相比，KK/Upj-Ay/J 小鼠的肥胖指標：腹圍和Lee's 指數(shù)顯著增加；空腹血糖和胰島素水平分別增高236.9%和310.3%（P ＜0.01）； 血脂指標中總膽固醇升高131%，三酰甘油升高141%，低密度脂蛋白膽固醇升高76%，高密度脂蛋白膽固醇水平升高160%（均P ＜0.01）（表1）， 符合MS 診斷標準，說明MS 模型選擇成功。

2.2 NaHS 對血糖和血胰島素水平的影響

給予NaHS 4 周后，MS+NaHS 組小鼠空腹血糖和胰島素比MS 組分別降低了24.2%和46.98%（P ＜0.05），提示NaHS 可以改善MS 的的高糖高胰島素水平。見表2。

2.3 NaHS 對骨骼肌細胞攝取2-NBDG 的影響

加入2-NBDG 20 min 后， 熒光顯微鏡下觀察可見，不同濃度NaHS 干預后，骨骼肌攝取2-NBDG 增加，熒光IA 值C、D 組與A 組比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），B、E 組與A 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），其由大到小排序依次為C 組＞D 組＞B組＞E 組＞A 組。 NaHS 濃度為100 mmol/L 時，骨骼肌攝取葡萄糖量達到最大值。 見圖1、2。

表1 代謝綜合征模型評價指標（s）

表1 代謝綜合征模型評價指標（s）

注：與CON 組比較，*P ＜0.01；FBG：空腹血糖；FIns：空腹胰島素；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

CON 組（n=10）MS 組（n=6）7.87±0.63 10.00±0.59*302.69±22.75 338.26±25.64*6.67±0.56 22.47±5.89*56.19±19.63 230.53±91.00*2.52±0.17 6.26±0.47*0.98±0.22 2.20±0.89*1.28±0.11 3.59±0.30*0.44±0.09 0.81±0.06*

表2 硫氫化鈉對代謝綜合征小鼠空腹血糖和胰島素的影響（s）

表2 硫氫化鈉對代謝綜合征小鼠空腹血糖和胰島素的影響（s）

注：與MS 組比較，#P ＜0.05

MS 組（n=6）MS+NaHS 組（n=6）22.47±5.89 17.03±6.77#230.53±91.00 122.22±33.04#

圖1 C2C12 細胞對2-NBDG 的攝?。ā?0）

圖2 各組2-NBDG 攝取的IA 值比較

2.4 NaHS 對NIT-1 細胞胰島素分泌功能的影響

在低糖（5.6 mmol/L 葡萄糖）刺激下，不同濃度NaHS對胰島細胞胰島素分泌水平無明顯影響。 在高糖（16.7 mmol/L 葡萄糖）刺激下，不同濃度NaHS 干預后，胰島素分泌水平差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），且隨著NaHS水平的升高，胰島素分泌水平下降越明顯。 見表3。

表3 不同濃度NaHS 對NIT-1 細胞胰島素分泌的影響（s）

表3 不同濃度NaHS 對NIT-1 細胞胰島素分泌的影響（s）

注：與NaHS 0 mmol/L 比較，*P ＜0.05

NaHS（mmol/L）0 50 100 200 400 5.6 16.7 13.5±0.2 16.3±2.1 13.2±0.5 14.2±0.8*12.2±1.3 13.4±1.2*12.8±0.6 13.1±0.8*12.3±1.2 12.7±1.0*

3 討論

與CON 組相比，KK/Upj-Ay/J 小鼠的肥胖指標體重、腹圍、Lee's 指數(shù)和空腹血糖、胰島素以及三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇均顯著升高（P <0.01），這與MS 診斷標準相符，說明本實驗選用的MS模型是成功的。

近年來，H2S 在胰島素抵抗及糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到人們關(guān)注。在本實驗中MS 組小鼠空腹血糖和胰島素水平均比CON 組顯著升高（P<0.05），而給予NaHS 4 周后，MS+NaHS 組小鼠血糖和胰島素分別比MS 組降低了24.2%和46.98%。 推測H2S 可能是通過增加胰島素靶器官對葡萄糖的攝取和利用來達到降低血糖的作用。 因此，本研究進一步觀察了NaHS對骨骼肌細胞葡萄糖攝取量的影響，結(jié)果表明，不同濃度的NaHS 干預后， 骨骼肌攝取葡萄糖增加 （均P ＜0.05），NaHS 濃度為100 mmol/L 時， 骨骼肌攝取葡萄糖量達到最大值。 表明H2S 可以通過提高胰島素敏感性，促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取來降低血糖。

高胰島素血癥是在胰島素抵抗的狀態(tài)下，胰島B細胞代償性分泌胰島素增加的結(jié)果，不僅會導致胰島B細胞功能的下降，還會損傷血管內(nèi)皮細胞，加速冠狀動脈粥樣硬化形成，導致左心室肥厚[9]，是冠心病、高血壓、高血脂、Ⅱ型糖尿病、肥胖、腦卒中等共同的發(fā)病基礎。 研究表明，不同濃度的H2S 對胰島B 細胞具有不同作用，低濃度的H2S 可通過ATP 敏感性K 通道（KATP）和不依賴于KATP 通道的其他機制抑制胰島素釋放， 高濃度的H2S 可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路導致胰島B 細胞壞死[3，10]。本實驗結(jié)果表明，外源性給予NaHS 后，小鼠血清胰島素水平均比MS 組降低（P ＜0.05），NIT-1 細胞在加入NaHS 后，胰島素分泌水平下降（P ＜0.05），且隨著外源性NaHS 濃度的增加，胰島素分泌下降越明顯，說明外源性NaHS 還可以抑制MS 的高胰島素分泌。

綜上所述，H2S 可以通過提高胰島素敏感性，促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取來降低血糖，從而改善了高血糖刺激高胰島素血癥發(fā)展的惡性循環(huán)，抑制胰島素分泌； 同時，H2S 在高糖條件下可以直接抑制胰島素分泌， 改善了MS 小鼠的高胰島素狀態(tài)。 另外，H2S 還作為體內(nèi)的“調(diào)停器”減輕高糖環(huán)境對胰島細胞造成的損害[11]。 因此，外源性H2S 可能通過多個方面在MS 小鼠中發(fā)揮血糖調(diào)節(jié)的重要作用。

[1] Reaven GM. Role of insulin resistance in human disease [J].Diabetes，1988，37（12）：1595-1607.

[2] Viktoria J，Edina K，Emoke N，et al.Supression of hemin-medi ated oxidation of low-density lipoprotein and subsequent endo thelial reactions by hydrogen sulfide（H2S）[J]. Free Radic Biol Med，2009，46（5）：616-623.

[3] Suzuki K，Olah G，Modis K，et al.Hydrogen sulfide replacement therapy protects the vascular endothelium in hyperglycemia by preserving mitochondrial function[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（33）：13829-13834.

[4] 林春喜，林建聰，郭潤民，等.硫化氫通過調(diào)控 通路對抗高糖誘導的心肌細胞氧化應激損傷[J].中國動脈硬化雜志，2013，21（1）：1-5.

[5] Feng X，Chen Y，Zhao J，et al. Hydrogen sulfide from adipose tissue is a novel insulin resistance regulator[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，380（1）：153-159.

[6] 吳璇，劉洪臣，呂嬌，等.胰島素對糖尿病大鼠下頜骨成骨細胞糖攝取的影響[J].口腔醫(yī)學研究，2010，26（3）：346-348.

[7] 陳宏，蔡德鴻，王梅，等.一氧化氮介導的細胞因子對大鼠胰島素分泌的影響[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，1998，14（4）：263-266.

[8] 宋秀霞，紀立農(nóng).國際糖尿病聯(lián)盟代謝綜合征全球共識定義[J].中華糖尿病雜志，2005，13（3）：178-180.

[9] Grundy SM，Cleeman JI，Daniel SR，et al. Diagnosis and mana gement of the metabolic syndrome：an American Heart Associ ation/National Heart，Lung，and Blood Institute scientific state ment：Executive Summary[J].Circulation，2005，112（17）：2735-2752.

[10] Yang G，Yang W，Wu L，et al.H2S，endoplasmic reticulum stress,and apoptosis of insulin-secreting beta cells[J].J Biol Chem，2007，282（22）：16567-16576.

[11] Kaneko Y，Kimura T，Taniguchi S，et al.Glucose-induced produ ction of hydrogen sulfide may protect the pancreatic beta-cells from apoptotic cell death by high glucose[J].FEBS Lett，2009，583（2）：377-382.