喻春釗 余 翔 王興偉 駱霞崗 李 泉 竺 慧 王偉林

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普通外科，江蘇南京 210011

胰腺癌是一種惡性程度高、進(jìn)展迅速、手術(shù)切除率低、預(yù)后極差的惡性腫瘤，術(shù)后5 年生存率為3%～8%[1]。 究其原因主要是因為胰腺癌發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于局部中晚期，存在胰周臨近許多重要器官的直接浸潤和轉(zhuǎn)移， 如何進(jìn)一步尋找更加有效的治療手段和方法，抑制胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移對于提高胰腺癌的治療效果和預(yù)防復(fù)發(fā)有著重要的作用和意義[2]。 人類Plk1 基因于1994 年由GoIsteyn 等[3]最先克隆報道，定位于16p12.3，mRNA 長約2.2 kb， 編碼的蛋白質(zhì)分子量約為67 kd。 本研究以Plk1 為靶基因，采用RNAi 技術(shù)沉默Plk1 基因表達(dá)， 觀察其與胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系及對細(xì)胞凋亡的影響，以期為胰腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鼠抗人Plk1 單克隆抗體（美國Zymed 公司），兔抗人Plk1 多克隆抗體 （美國Calbiochem 公司），PCR 引物和shplk1-1、shplk1-2、shplk1-3、shplk1-4 由上海鈺森生生物試劑公司合成；小牛血清，RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司），RNA 酶A（RNaseA）（Sigma 公司），Trizol（MRC 公司），總RNA 提取試劑盒（美國Promega 公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription System（美國Promega 公司），Rneasy Mini Kit（美國QIAGEN 公司），DL2000 DNA Marker，RT-PCR 試 劑 盒TaKaRa Taq（日本TaKaRa 公司），孔板，24 孔板（Costar 公司），瓊脂糖（美國Merck 公司），細(xì)胞裂解用蛋白酶抑制劑混合片（Roche 公司），化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（安瑪西亞公司），Matrigel 膠購自美國BD 公司，Transwell 小室系統(tǒng)購自美國Coster 公司，產(chǎn)品其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫， 細(xì)胞分別置于含10%小牛血清， 抗生素（含100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素）和2 mmol/L 谷胺酰胺的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，在37℃、%CO2、濕度為95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d 傳代1 次。 實驗選用對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）混合消化液消化，用含10%的小牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋成單細(xì)胞懸液（106/mL）以4000 細(xì)胞/孔接種于6 cm 培養(yǎng)皿中進(jìn)行實驗，將實驗分為對照組（未處理組）、空質(zhì)粒組、shplk1-1 組、shplk1-2 組、shplk1-3 組、shplk1-4組， 應(yīng)用Invitrogen 公司轉(zhuǎn)染試劑盒按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h 后提取總Plk1 RNA 和蛋白。

1.3 RT-PCR 檢測目的基因Plk1 mRNA 的表達(dá)

用Rneasy Mini Kit 試劑盒提取各實驗組細(xì)胞總RNA，按照Promega 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作手冊進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。 Plk1 引物序列：上游引物5'-AAGAGATCCCGGAGGTCCTA-3'；下游引物5'-TCATTCAGGAAA AGGTTGCC-3' 產(chǎn)物長度450 bp。 擴增條件： 預(yù)變性94℃5 min，94℃30 s，63℃45 s，72℃1 min，30 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。 以β-actin 為內(nèi)參，引物序列：上游引物5'-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3'；下游引物5'-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3' 產(chǎn)物長度219 bp。 PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上分離，通過Bio-Rad 公司凝膠分析軟件分析條帶光密度。

1.4 Western blot 檢測目的基因Plk1 蛋白的表達(dá)

收集“1.3 項”下同期處理的細(xì)胞提取蛋白。 細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌兩次后加入150 μL 細(xì)胞裂解液 （50 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，0.02%疊氮鈉，0.1%SDS，100 μg/mL 苯甲基磺酰氟，1 μg/mL Aprotinin，1% Nonidet P-40，0.5%去氧膽酸鈉）， 冰上靜置20 min。 用細(xì)胞刮匙將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中刮落，收集于Ep 管中，置冰上超聲細(xì)胞粉碎儀超聲處理20 s。12 000 r/min，4℃離心15 min，收集上清，用Bio-Rad公司的DC Protein Assay 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。 以總蛋白量20 μg/孔進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完畢，將凝膠上的蛋白用濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。 膜用含5%脫脂牛奶的TBS 室溫封閉1 h，TBS 洗3 遍，加以封閉液稀釋的抗Plk1 抗體（1∶200）和抗β-actin 抗體（1∶500），4℃過夜，TBS 洗3 遍，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育 （1∶3000）1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光，暗室曝光顯影，計算機分析。

1.5 Transwell 腫瘤細(xì)胞侵襲實驗

將放于4℃過夜融化的Matrigel 膠用無血清培養(yǎng)基按比例為1∶3 稀釋配成膠，將小室放在24 孔板內(nèi)，每個小室加入80 μL 稀釋好的Matrigel 膠， 分3 次鋪，每次間隔10 min，每次鋪完膠后在37℃下干燥；最后一次干燥10 min 后，在上層小室內(nèi)分別加入4組細(xì)胞（未處理組、空質(zhì)粒組、shplk1-3 組和對照組）各100 μL（濃度為1×106/mL）個。 下層小室各加入10%的FBS，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)72 h；每組細(xì)胞設(shè)3 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次，棄去上室中的培養(yǎng)液，并擦去Matrigel 膠，濾膜冰甲醇固定1 min 后行蘇木精-伊紅染色（HE），棉棒輕輕擦去濾膜頂層的細(xì)胞，進(jìn)行侵襲實驗結(jié)果觀察：各選擇5 個無重疊區(qū)，于高倍鏡（200×）下攝片，同時分別計數(shù)24 孔板中的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果以均值表示。

1.6 細(xì)胞遷移實驗

取傳代48h 長勢良好的兩組細(xì)胞（空質(zhì)粒組和shplk1-3 組）制備單細(xì)胞懸液，按1×105個細(xì)胞（500 μL）/孔將細(xì)胞加入6 孔板，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37℃孵育培養(yǎng)。采用劃痕法用消毒過的槍頭在80%匯合的單層細(xì)胞表面劃出一無細(xì)胞的細(xì)痕，用PBS 漂洗3 次以除去劃下的細(xì)胞，加入新鮮無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)觀察12、24 h，在倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 12.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。 以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測各組細(xì)胞Plk1 mRNA 的含量

以β-actin 作為內(nèi)對照， 比較Plk1 的條帶差異明顯，對照組、空質(zhì)粒組、shplk1-1 組、shplk1-2 組、shplk1-3 組、shplk1-4 組的Plk1 mRNA 相對量分別為（2.38±0.19）、（2.14±0.16）、（1.96±0.14）、（1.82±0.17）、（1.22±0.12）、（1.56±0.15），shplk1 轉(zhuǎn)染各組Plk1 mRNA 的表達(dá)低于對照組和空質(zhì)粒組， 其中以shplk1-3組Plk1 mRNA 相對量最低，與各組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。 見圖1。

圖1 RT-PCR 檢測各組細(xì)胞Plk1 mRNA 含量比較

2.2 Western blot 法測定Plk1 蛋白的表達(dá)

以β-actin 為內(nèi)參，可見68 kd 左右的蛋白帶，它與Plk1 抗體特異性結(jié)合，證明為Plk1 表達(dá)的蛋白，對照組、 空質(zhì)粒組、shplk1-1 組、shplk1-2 組、shplk1-3組、shplk1-4 組的Plk1 相對量分別為（1.243±0.143）、（1.122±0.121）、（0.953±0.018）、（0.775±0.020）、（0.275±0.154）、（0.543±0.125），shplk1 轉(zhuǎn)染各組Plk1 蛋白相對量相對較低， 其中以shplk1-3 轉(zhuǎn)染組顯著低于其它各組（P < 0.01）。 見圖2。

圖2 Western blot 檢測各組細(xì)胞Plk1 蛋白表達(dá)比較

2.3.Transwell 侵襲實驗

對照組、 空質(zhì)粒組、shplk1-3 組穿過人工基底膜的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（195±16）、（176±13）、（83±5）個（圖3）。 結(jié)果顯示， 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的shplk1-3 組穿過Matrigel 膠的侵襲細(xì)胞數(shù)較空質(zhì)粒組和對照組明顯減少（圖4），方差分析顯示差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；而其余兩組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

圖3 三組細(xì)胞侵襲能力比較

圖4 三組細(xì)胞穿過人工基底膜圖

2.4 細(xì)胞遷移實驗

在兩組細(xì)胞內(nèi)劃出相同寬度的痕跡后，空質(zhì)粒組比shplk1-3 組細(xì)胞遷移速度快，12 h 后，空質(zhì)粒組已侵入近1/2 距離，而shplk1-3 組僅侵入1/3 左右，24 h后空質(zhì)粒組已經(jīng)基本融合，而shplk1-3 組僅侵入1/2左右（圖5）。 結(jié)果表明，shplk1 組細(xì)胞遷移能力明顯低于對照組。

圖5 兩組細(xì)胞在0、12、24 h 的遷移圖

3 討論

胰腺癌是一種惡性度很高的腫瘤，臨床上雖然采取了手術(shù)、化療、放療等多種治療方法，但療效卻不十分理想，重要原因是胰腺癌發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于局部浸襲和轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步研究和探討胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制仍然是胰腺癌治療研究領(lǐng)域的難點和熱點[4]。 RNAi技術(shù)在腫瘤上的研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展，目前大多數(shù)學(xué)者通過RNAi 沉默癌基因、 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期、對腫瘤新生血管的干預(yù)以及對參與腫瘤放化療過程中與耐藥相關(guān)的特定基因的干預(yù)來研究腫瘤中特定基因的功能與探索相關(guān)的治療手段[5]。多項研究表明，Plk-1 在胰腺癌、直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、食管癌甲狀腺癌、鼻咽癌、子宮頸癌、肝轉(zhuǎn)移癌及前列腺癌組織中過表達(dá)，其過表達(dá)與腫瘤組織分級、惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)[6-11]。 Plk-1 是一種存在于哺乳動物細(xì)胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶， 通過參與調(diào)控細(xì)胞周期G2/M 期檢測點的功能對細(xì)胞周期的運行發(fā)揮重要作用，Plk-1 對控制細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性和染色體分配能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖與分裂，Plk1 已被作為重要的分子藥物治療靶點[12-14]。 筆者前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)， 中心體Plk1 在胰腺癌組織細(xì)胞中的高表達(dá)與其多藥耐藥機制密切相關(guān)，用RNAi 技術(shù)降低Plk1 的表達(dá)增強胰腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性[5，15]。 但是通過下調(diào)Plk1 的表達(dá)能否抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力目前沒有報道，因此本研究采用RNAi 干預(yù)Plk1 的表達(dá)， 研究靶向抑制Plk1 治療胰腺癌的可行性， 為胰腺癌的治療尋找一種新方法[16]。在本試驗中， 采用針對Plk1 的RNAi 來干預(yù)Plk1 的表達(dá)， 通過檢測轉(zhuǎn)染shplk1 的胰腺癌細(xì)胞， 來進(jìn)行Plk1 mRNA、Plk1 蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染shplk1-3 的AsPC-1 細(xì)胞中Plk1mRNA 和蛋白質(zhì)水平明顯低于未處理組、空質(zhì)粒組和對照組，表明構(gòu)建的shplk1-3 能夠明顯的抑制Plk1 的表達(dá)； 同時對該株細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞遷移和侵襲實驗， 發(fā)現(xiàn)與空質(zhì)粒組、未轉(zhuǎn)染組以及對照組相比，轉(zhuǎn)染shplk1-3 的AsPC-1，生長明顯變慢、活性降低、侵襲能力減弱，顯示出其對胰腺癌細(xì)胞良好的干預(yù)作用。 從而進(jìn)一步證明Plk1可以作為胰腺癌治療的一個良好靶點， 提示對Plk1的干擾可能是一個有深遠(yuǎn)前景的治療腫瘤的策略。

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