王夢(mèng)瑤， 王蘇美， 左應(yīng)林， 王杜娟， 劉 琴， 王春華， 卜憲章， 楊惠玲△

(1中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州510080;2中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510275)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)高發(fā)于中國(guó)南方地區(qū)，具有明顯的地區(qū)性和家族聚集性［1］。放療為鼻咽癌的首選療法，但由于放療耐受等導(dǎo)致30% ～40%病人發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響放療病人的預(yù)后［2］，因此尋找可抑制鼻咽癌細(xì)胞活性且逆轉(zhuǎn)輻射抗拒的小分子化合物，是提高鼻咽癌病人5 年生存率的關(guān)鍵。本課題組卜憲章等合成的4-芳甲叉類(lèi)等姜黃素衍生物，初篩結(jié)果顯示其具有廣譜抗癌活性，其中包括對(duì)CNE-2 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用［3］，而4-芳甲叉類(lèi)姜黃素衍生物T83 是否具有逆轉(zhuǎn)輻射抗拒的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬采用MTT 法、Hoechst 33342 染色法結(jié)合熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、Western blotting 和qRT-PCR 方法檢測(cè)和比較T83 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的同源不同輻射抗拒的鼻咽癌細(xì)胞CNE-2R［4］和CNE-2 細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位、線粒體凋亡通路相關(guān)凋亡蛋白和細(xì)胞PTEN/Akt/p27 mRNA 水平等的影響，以闡明T83 抑制鼻咽癌細(xì)胞活性且逆轉(zhuǎn)輻射抗拒的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為逆轉(zhuǎn)鼻咽癌輻射抗拒的治療提供新靶點(diǎn)和潛在抗癌制劑。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞 低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2 購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;鼻咽癌輻射抗拒細(xì)胞株CNE-2R為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 藥物及實(shí)驗(yàn)試劑 T83 由中山大學(xué)藥學(xué)院卜憲章實(shí)驗(yàn)室合成。RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;四甲基偶氮唑鹽［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT］、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和羅丹明123(rhodamine 123，Rh123)均購(gòu)自Sigma;Hoechst 33342 購(gòu)自Life Technologies;膜連蛋白V(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏公司;procaspase-3、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)鼠抗人單克隆抗體和HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 均購(gòu)自Cell Signaling Technologies;procaspase-9 鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology;β-actin 鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自Sigma;Trizol reagent 購(gòu)自Invitrogen。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 SUNRISE 全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Tecan;IX71 倒置熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus;流式細(xì)胞儀購(gòu)自Becton Dickinson;分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞用含10%新生牛血清、青-鏈霉素的RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT 法檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞的活性 用胰酶(2.5 g/L)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96 孔板(密度為3 ×103cells/well)，每孔200 μL。貼壁12 h，實(shí)驗(yàn)組各孔分別加入藥物200 μL，T83 終濃度為0.05、0.15、0.3、0.5 和0.7 μmol/L，對(duì)照組加入含0.2%DMSO 的培養(yǎng)基200 μL/well，空白組加入培養(yǎng)基200 μL/well，每組設(shè)8 孔，重復(fù)3 次。藥物作用24、48 和72 h 后，加入20 μL MTT(5 g/L)溶液，在37 ℃、5%CO2條件下孵育3.5 h。吸出各孔中液體，加入150 μL DMSO，振蕩5 ～10 min 使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)為570 nm 處測(cè)量各孔的吸光度(A)值。細(xì)胞生存率(%)=A處理組/(A處理組-A空白組)×100%。

2.3 Hoechst 33342 染色結(jié)合熒光顯微鏡觀測(cè)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的形態(tài) 接種細(xì)胞于6 孔板(密度為2 ×105cells/well)，0.3 和0.6 μmol/L T83 作用48 h 后，PBS 洗2 遍，用甲醇固定20 min 后Hoechst 33342 染色15 min，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 Annexin Ⅴ/碘化丙啶( propidium iodide，PI) 雙染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡 接種細(xì)胞于6 孔板(密度為2 ×105cells/well)，0.1、0.2 和0.4 μmol/L T83 作用48 h 后，用無(wú)EDTA 胰酶消化收集細(xì)胞，PBS 洗2 遍離心棄上清，用Annexin Ⅴ/PI雙染色標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率。

2.5 Rh123 染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞的線粒體膜電位 接種細(xì)胞于6 孔板(密度為2 ×105cells/well)，0.4 和0.8 μmol/LT83 作用36 h 后，用無(wú)EDTA 胰酶消化收集細(xì)胞，PBS 洗2 遍離心棄上清，將細(xì)胞重懸于0.2 mL 的5 g/L Rh123 染液中，37℃避光染色30 min，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位。

2.6 Western blotting 法檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞procaspase-3/procaspase-9/Cyt-C 的蛋白表達(dá)水平 0.2、0.4 和0.8 μmol/L T83 作用48 h 后，收集全蛋白細(xì)胞蛋白標(biāo)本，常規(guī)BCA 方法蛋白定量。制備15%聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳(1. 5 ～2 h)，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜(60 min)，室溫5%BSA 封閉1 h，加Ⅰ抗孵育PVDF 膜4 ℃過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，加Ⅱ抗孵育60 min，TBST 洗膜3 次，ECL 發(fā)光液顯色曝光，Quantity One 軟件分析結(jié)果，以β-actin 為內(nèi)參照。

2.7 qRT-PCR 檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞PTEN/Akt/p27 的mRNA 水平 0.2 和0.4 μmol/L T83 作用24 h 后，用Trizol 提取總RNA 并用分光光度計(jì)檢測(cè)其RNA的純度和濃度。按照Invitrogen 公司的qRT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，2-ΔΔCt方法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)分析，以β-actin 為內(nèi)參照。PTEN 的引物:正義鏈5'-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3'，反義鏈5'-TTTGGCGGTGTCATAATGTCTT-3';Akt 的引物:正義鏈5'-TCTTTGCCGGTATCGTGT-3'，反義鏈5'-TGTCATCTTGGTCAGGTGGT-3';P27 的引物:正義鏈5'-CGAGATCTGATGTCAAACGTGCGAGT-3'，反義鏈5'-CTGAATTCTTGACGTCTTCTGAGGCC-3'。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean ±SEM)表示，連續(xù)型數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，離散型數(shù)據(jù)的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 T83 對(duì)NPC 細(xì)胞活性的影響

T83 作用24、48 和72 h 后，NPC 細(xì)胞的存活率見(jiàn)表1。采用IC50軟件統(tǒng)計(jì)得到T83 作用于CNE-2R 細(xì)胞的IC50分別為0.90、0.40 和0.20 μmol/L，作用于CNE-2 細(xì)胞的IC50分別為1.80、0.50 和0.40 μmol/L，T83 對(duì)CNE-2R 細(xì)胞活性抑制作用明顯于CNE-2 細(xì)胞，且對(duì)2 種細(xì)胞均呈劑量時(shí)間依賴性。

表1 T83 對(duì)CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞活性的影響Table 1. Effect of T83 on the viability of CNE-2R and CNE-2 cells (%.Mean±SEM. n=3)

2 T83 對(duì)NPC 細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

Hoechst 33342 染色結(jié)果顯示，T83 作用48 h 后可使NPC 細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變。隨著藥物濃度的升高細(xì)胞核體積明顯減小，核形態(tài)發(fā)生變化，如染色質(zhì)濃縮、邊集和染色質(zhì)分割成塊狀;對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)完整，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Effects of T83 on the apoptotic morphology of CNE-2R and CNE-2 cells (Hoechst 33342 staining，× 200;magnification in the upper right images，×400).圖1 T83 對(duì)CNE-2 和CNE-2R 細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

3 T83 對(duì)NPC 細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2、3，T83 作用48 h 對(duì)CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞具有劑量依賴性地誘導(dǎo)凋亡的作用，并以晚期凋亡為主。高劑量組中，CNE-2R細(xì)胞的晚期凋亡率為27.26%，明顯高于CNE-2 細(xì)胞的8.15%，差異顯著，說(shuō)明T83 可較特異地加速CNE-2R 細(xì)胞凋亡。

4 T83 對(duì)NPC 細(xì)胞線粒體膜電位的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，T83 作用36 h 可誘導(dǎo)CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞線粒體膜電位下降且呈劑量依賴性。0.4 和0.8 μmol/L T83 使CNE-2R 細(xì)胞線粒體膜電位下降率分別為56. 08% 和87. 71%，CNE-2 細(xì)胞分別為20.48%和50.47%;2 株細(xì)胞處理組和對(duì)照組比差異顯著;在相同藥物濃度下2 株細(xì)胞的線粒體膜電位降低率差異顯著。

Figure 2. Effects of T83 on the apoptosis of CNE-2R and CNE-2 cells.Upper right:late apoptosis;lower right:early apoptosis;lower left:viable cell.圖2 T83 對(duì)CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3. Effects of T83 on the late apoptotic rates of CNE-2R and CNE-2 cells. Mean ± SD. n = 3. * P ＜0. 05，＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.圖3 T83 對(duì)CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞晚期凋亡的影響

5 T83 對(duì)NPC 細(xì)胞procaspase-3/procaspase-9/Cyt-C 蛋白表達(dá)的影響

Western blotting 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5，T83 作用48 h后，CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞中procaspase-3 和procaspase-9 蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性降低，且在CNE-2R 細(xì)胞中更加顯著;Cyt-C 蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性升高，且低劑量組中，CNE-2R 細(xì)胞的Cyt-C蛋白表達(dá)已有明顯升高。

6 T83 對(duì)NPC 細(xì)胞PTEN/Akt/p27mRNA 的影響

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6 ～8，T83 作用24 h 后，CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞中PTEN 和p27 mRNA 水平呈劑量依賴性升高，且在CNE-2R 細(xì)胞中T83 濃度為0.4 μmol/L 時(shí)兩者的mRNA 水平顯著升高;在2 株細(xì)胞中Akt mRNA 水平呈劑量依賴性降低，處理組與對(duì)照組相比差異顯著。

討 論

大量研究證明姜黃素衍生物利用度低和代謝速度快等缺點(diǎn)限制其在抗癌治療中的應(yīng)用［5］，近年來(lái)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且抗癌活性更加顯著的姜黃素衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的研究已成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)［5-6］，但各類(lèi)衍生物的抗癌活性和作用機(jī)制不相同［7］。我們已合成一系列姜黃素衍生物，同時(shí)研究結(jié)果顯示4-芳甲叉類(lèi)姜黃素衍生物具有廣譜抗癌活性，通過(guò)抑制NF-κB 和Akt 通路活性而抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［3］，但姜黃素衍生物是否具有逆轉(zhuǎn)輻射抗拒的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。我們的研究結(jié)果首次揭示T83 可較特異抑制輻射抗拒鼻咽癌細(xì)胞的活性，且具有時(shí)間劑量依賴性。雖然本研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的單羰基姜黃素衍生物B50 和B67［5，8］的作用相似，但與B50 和B67 作用CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞24、48 和72 h 后的IC50(B50:8.06、2.49 和1.42 μmol/L，8.18、3.00 和1.75 μmol/L;B67:3.96、2.59 和0.89 μmol/L，8.84、3.55 和1.10 μmol/L)比，T83 的IC50明顯降低(0.90、0.40 和0.20 μmol/L，1.80、0.50 和0.40 μmol/L)，這表明T83 較其它類(lèi)姜黃素衍生物具有更強(qiáng)的抗癌活性和更好的逆轉(zhuǎn)輻射抗拒的作用，提示T83 是一種更具有逆轉(zhuǎn)鼻咽癌輻射抗拒的潛在抗癌制劑。

Figure 4. Effects of T83 on mitochondrial membrane potential of CNE-2R and CNE-2 cells.圖4 T83 對(duì)CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Figure 5. Effects of T83 on procaspase-3，procaspase-9 and Cyt-C protein expression in CNE-2R and CNE-2 cells.圖5 T83 對(duì)CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞procaspase-3，procaspase-9，Cyt-C 蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. Effect of T83 on PTEN mRNA expression in CNE-2R and CNE-2 cells. Mean ± SD. n =3. ＊＊P ＜ 0. 01 vs 0 μmol/L.圖6 T83 對(duì)CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞PTEN mRNA 的影響

Figure 7. Effect of T83 on Akt mRNA expression in CNE-2R and CNE-2 cells.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.圖7 T83 對(duì)CNE-R2 和CNE-2 細(xì)胞Akt mRNA 的影響

Figure 8. Effect of T83 on p27 mRNA expression in CNE-2R and CNE-2 cells. Mean ± SD. n =3. ＊＊P ＜ 0. 01 vs 0 μmol/L.圖8 T83 對(duì)CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞p27 mRNA 的影響

為闡明T83 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞作用的細(xì)胞機(jī)制，我們通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)觀察鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T83 作用48 h 后CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞出現(xiàn)明顯染色質(zhì)濃集、邊集和染色質(zhì)分割成塊狀等凋亡形態(tài)學(xué)改變;T83 作用48 h 后CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞凋亡率明顯升高，以晚期凋亡為主，且以CNE-2R 細(xì)胞更為顯著。同時(shí)我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T83 作用后2 株細(xì)胞的線粒體膜電位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞的線粒體膜電位顯著下降，呈劑量依賴性，且以前者更為顯著。進(jìn)一步我們通過(guò)Western blotting 檢測(cè)T83 作用后2 株細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞中procaspase-3和procaspase-9 蛋白水平降低，且在CNE-2R 細(xì)胞中更加顯著;低劑量T83 即可誘導(dǎo)CNR-2R 細(xì)胞線粒體釋放Cyt-C，引起Cyt-C 表達(dá)水平升高。這些結(jié)果與Wang 等［9］和Ren 等［10］的報(bào)道相似，我們認(rèn)為T(mén)83 作用于CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞36 h 后，首先引起線粒體膜電位的下降，T83 作用48 h 時(shí)才出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)和百分率的升高，因此說(shuō)明線粒體膜電位的下降是凋亡的早期表現(xiàn)，一旦線粒體膜電位損耗，通過(guò)釋放Cyt-C 等促凋亡蛋白，引起procaspase-9 的活化，進(jìn)而激活其下游的procaspase-3 導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程;同時(shí)說(shuō)明T83 通過(guò)較特異地啟動(dòng)線粒體凋亡途徑而誘導(dǎo)輻射抗拒鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

大量研究報(bào)道了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及PTEN/Akt/p27 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活［11-12］。為進(jìn)一步探討T83 作用的分子機(jī)制，我們利用qRT-PCR 法檢測(cè)PTEN/Akt/p27 mRNA 表達(dá)量，結(jié)果顯示T83 作用24h 后，CNE-2R 和CNE-2 細(xì)胞中PTEN 和p27 mRNA 的表達(dá)明顯增加，而Akt mRNA 的表達(dá)明顯降低，呈劑量依賴性，且以前者更加顯著。這提示T83加速鼻咽癌細(xì)胞凋亡可能通過(guò)抑制PTEN/Akt/p27信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路mRNA 水平，至于T83 是否影響該通路的蛋白水平有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，T83 通過(guò)較特異地調(diào)控PTEN/Akt/p27 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)啟動(dòng)線粒體凋亡途徑加速凋亡而較特異地抑制輻射抗拒鼻咽癌細(xì)胞的活性，為逆轉(zhuǎn)鼻咽癌輻射抗拒的治療提供新靶點(diǎn)和潛在抗癌制劑。

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