韓 莉， 楊欽河， 楊雪松， 胡巢鳳， 張玉佩， 馮高飛， 王文晶，何秀敏， 王彥平， 程少冰， 金 玲， 閆海震， 黃 進(jìn)

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院，2醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，3醫(yī)學(xué)院組胚系再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，4醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系、國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510632)

核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)是一種十分重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)動(dòng)物模型和患者中，肝臟NF-κB 的表達(dá)顯著增加［1-2］，IκB 激酶β(IκB kinase β，IKKβ)是IκB 激酶復(fù)合體(IκB kinase，IKK)中的一個(gè)催化亞基，通過(guò)經(jīng)典途徑激活NF-κB，參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等一系列病理生理過(guò)程［3］，實(shí)驗(yàn)證明IKKβ 在NF-κB 信號(hào)通路活化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［4-5］。活化的NF-κB 通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控下游靶基因高表達(dá)，其產(chǎn)物參與肝臟的急慢性炎癥、肝纖維化、肝細(xì)胞再生和凋亡等病理生理過(guò)程［6］。NF-κB 的激活可能是肝臟和全身胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的根源，參與NASH 的發(fā)病。因此，抑制IKKβ 和NF-κB mRNA 及蛋白的表達(dá)，可能成為有效防治NASH 的途徑之一。NASH 的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，目前尚不完全清楚，研究認(rèn)為NASH 是一種遺傳、環(huán)境及代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病，其發(fā)病機(jī)制與IR、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化等作用相關(guān)，其中從炎癥信號(hào)通路的研究成為近年研究的熱點(diǎn)。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)［7-9］，疏肝健脾方藥可以抑制Kupffer 細(xì)胞ERK1/2 蛋白的表達(dá)，下調(diào)肝組織NFκB p65 蛋白的表達(dá)，下調(diào)IKKβ mRNA 和蛋白表達(dá)，從而具有良好的抗NASH 效果。本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察大鼠Kupffer 細(xì)胞IKKβ 和NF-κB mRNA 及蛋白在疏肝健脾方藥干預(yù)后的變化，探討疏肝健脾方藥抗大鼠NASH 的分子機(jī)制，旨在闡明NASH 發(fā)病機(jī)制為臨床防治提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠48 只，體重(200 ±20)g，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)為 SCXK (粵)2008-0020;粵監(jiān)證字為2008A020。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

1.2.1 疏肝方( 柴胡疏肝散) 柴胡6 g，川芎5 g，枳殼5 g，陳皮6 g，白芍5 g，香附5 g，炙甘草3 g。

1.2.2 健脾方( 參苓白術(shù)散) 人參15 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，薏苡仁9 g，砂仁6 g，山藥15 g，桔梗6 g，白扁豆12 g，蓮子9 g，炙甘草9 g。

1.2.3 綜合方 柴胡疏肝散與參苓白術(shù)散合方。

1.3 主要試劑 Nycodenz 細(xì)胞分離液(No.1002424-1)購(gòu)自瑞典Axis-shield;Ⅳ型膠原酶(No.C8160-100)購(gòu) 自 Gbico;Anti-Lysozyme (No. bs-0816R)購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;Quant cDNA 第1 鏈合成試劑盒(No. KR103)、SYBR Green熒光定量PCR 試劑盒(No. FP202)購(gòu)自北京天根生化有限公司;Anti-IKKβ(No.2684)和Anti-Phospho-IKKβ(No.9958)購(gòu)自Cell Signaling Technology;Anti-NF-κB p65(No.sc-372)購(gòu)自Santa Cruz;核蛋白提取試劑盒和BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為8 組，每組6 只。分別為:正常組(蒸餾水灌胃)、模型組(蒸餾水灌胃)、高劑量疏肝方組(9. 6 g·kg－1·d1柴胡疏肝散灌胃)、低劑量疏肝方組(3.2 g·kg－1·d－1柴胡疏肝散灌胃)、高劑量健脾方組(30.0 g·kg－1·d－1參苓白術(shù)散灌胃)、低劑量健脾方組(灌服10.0 g·kg－1·d－1參苓白術(shù)散)、高劑量綜合方組(39.6 g·kg－1·d－1柴胡疏肝散與參苓白術(shù)散合劑)和低劑量綜合方組(13.2 g·kg－1·d－1柴胡疏肝散與參苓白術(shù)散合劑)。各方藥組成和劑量均參考上?？茖W(xué)技術(shù)出版社《方劑學(xué)》［10］。低劑量組藥物為臨床常規(guī)用量，高劑量組藥物為臨床常規(guī)用量的3 倍用量。上述藥物均為中藥配方顆粒劑，使用前蒸餾水調(diào)配，深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，購(gòu)于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房。

2.2 大鼠模型建立 NASH 大鼠模型的建立參照我們以往的實(shí)驗(yàn)方法［7-9］，并加以改進(jìn)。除正常組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)外，其余各組均以高脂飼料喂養(yǎng)。在施以造模因素的同時(shí)，各組按10 mL·kg－1給予相應(yīng)的藥物或蒸餾水灌胃，各藥物組大鼠相應(yīng)的藥物劑量按大鼠體表面積折算，每天早晚各1 次。各組動(dòng)物自由飲水進(jìn)食，分籠飼養(yǎng)于暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)［(24 ±2)℃，明暗各12 h］，每周定時(shí)稱重，根據(jù)體重調(diào)整藥量，連續(xù)16 周。

2.3 標(biāo)本采集與樣本制備 各組動(dòng)物均于末次給藥后，禁食不禁水12 h，3% 戊巴比妥鈉腹腔麻醉(1mL/kg)，剖腹，游離門靜脈主干并插管固定，迅速注入肝素鈉2 mL 1.5 ×106U/L)。采用離體循環(huán)灌注Ⅳ型膠原酶，差速離心、密度梯度離心和選擇性貼壁分離Kupffer 細(xì)胞，Typan blue 染色和流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)進(jìn)行細(xì)胞活性和純度鑒定。

2.3.1 Kupffer 細(xì)胞分離與純化 細(xì)胞上清液經(jīng)800 ×g 4 ℃離心10 min，沉淀加RPMI-1640 培養(yǎng)基垂懸。取15 mL 離心管若干支，最下層鋪24%Nycodenz 2.5 mL，傾斜離心管45°用滴管沿管壁緩緩滴加11%Nycodenz 2.5 mL，用同樣方法最上層加入2.5 mL 細(xì)胞懸液，1 500 × g 4 ℃離心15 min(正常組Kupffer 細(xì)胞分離采取10.8% Nycodenz－17.2% Nycodenz 密度梯度)。離心完畢，可看到4 個(gè)分層:最上層是含有細(xì)胞碎片的培養(yǎng)基;最上層和11% Nycodenz 之間呈云霧狀細(xì)胞層為內(nèi)皮細(xì)胞層;24% Nycodenz 和11% Nycodenz 之間云霧狀細(xì)胞層為Kupffer細(xì)胞層;管底沉淀為部分肝細(xì)胞、紅細(xì)胞及細(xì)胞碎片。吸管逐層吸棄前兩層，收集Kupffer 細(xì)胞層于15 mL 離心管中加Gey's 平衡鹽溶液垂懸，800 ×g 4 ℃離心5 min 2 次洗滌，沉淀用10%胎牛血清培養(yǎng)基垂懸，取懸液9∶1 Typan blue 進(jìn)行染色，調(diào)整細(xì)胞濃度為(2 ～5)×109/L，接種于培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Kupffer 細(xì)胞貼壁能力很強(qiáng)，分離后15 min 開(kāi)始貼壁，3 h 后幾乎完全貼壁，洗去未貼壁的細(xì)胞，更換新培養(yǎng)基，此即為純化的Kupffer細(xì)胞。

2.3.2 Kupffer 細(xì)胞FCM 鑒定 細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，PBS 洗滌2 次，加入固定劑固定15 min，離心去上清后加入破膜試劑，加入Ⅰ抗Anti-Lysozyme 室溫孵育30 min，加入Ⅱ抗(羊抗兔IgG-FITC)室溫孵育30 min，用破膜試劑洗滌2 次后上機(jī)檢測(cè)。

2.3.3 Kupffer 細(xì)胞IKKβ 和NF-κB p65 mRNA 測(cè)定

Trizol 提取Kupffer 細(xì)胞RNA，測(cè)定含量并計(jì)算濃度，采用Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄法，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。從 GenBank 中 查 找 大 鼠 NF-κB (XM _342346.4)、IKKβ (NM_053355.2)和內(nèi)參照GAPDH(NM_017008.3)的cDNA 序列，引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。IKKβ 上游引物5’-CCGTGACTGTTGACTACTG-3’，下游引物5’-GTCCACTTCGCTCTTCTG-3’;NF-κB 上 游引 物5’-TGCATTCTGACCTTGCCTAT-3’，下 游 引 物 5 ’-TCCAGTCTCCGAGTGAAGC-3’;GAPDH 上游引物5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3’，下游引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3’。反應(yīng)體系:2.5 ×Real Master Mix/20 ×SYBR solution 9 μL，上、下游引物各2 μL，DNA 模板1 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)至總體積20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃10 s，GAPDH 57.5 ℃、IKKβ 52 ℃、NF-κB 60 ℃退火20 s，68 ℃延伸30 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)完成后再于72℃至95 ℃，持續(xù)5 ～10 s 繪制熔解曲線。反應(yīng)完畢，采用Opticon Monitor 3. 1 軟件分析結(jié)果，用公式2－ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量。Ct 值=每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔΔCt = (Ct目的基因－Ct內(nèi)參照基因)實(shí)驗(yàn)組－(Ct目的基因－Ct內(nèi)參照基因)正常組，以未處理的空白組基因表達(dá)水平為1，2－ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于正常組的變化倍數(shù)。

2.3.4 Western blotting 分析Kupffer 細(xì)胞中IKKβ 和NF-κB p65 蛋白的表達(dá) 計(jì)數(shù)新鮮分離的細(xì)胞，每(5 ～10)×106加入1 mL RIPA 裂解液，對(duì)于核蛋白提取(檢測(cè)NF-κB 表達(dá)水平)參照碧云天細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(No. P0027)，全程冰上操作。勻漿，裂解30 min 后，將裂解液移至1.5 mL EP 管中，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清置于－80 ℃保存。配制BSA 標(biāo)準(zhǔn)液，混勻后室溫放置2 min，在分光光度計(jì)上比色分析，檢測(cè)樣品蛋白含量。配置凝膠，上樣，電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移與膜的封閉，將濾紙和濾膜在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡15 min，將濾膜放在平皿中，用1 × 麗春紅溶液于脫色搖床上輕搖，染膜5 min 左右，然后用雙蒸水洗，將濾膜放在平皿中，封閉液室溫震搖1 ～2 h，4 ℃過(guò)夜，封閉結(jié)束后，將膜放入一塑料帶中，加入溶有Ⅰ抗的新鮮配制的封閉液;4 ℃輕輕振搖2 h，用封閉液清洗3 次，每次約10 ～15 min，以除去過(guò)量的Ⅰ抗;將膜轉(zhuǎn)入另一塑料袋中，加入溶于封閉液的Ⅱ抗;封口后室溫振搖孵育1 ～2 h;取出濾膜，用TBST 漂洗3 ～5 次，每次10 ～15 min，洗去未結(jié)合的Ⅱ抗，曝光、顯影、定影，凝膠圖像分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)或中位數(shù)(最小值～最大值)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)，中位數(shù)比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，以P ＜0. 05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Kupffer 細(xì)胞計(jì)數(shù)、活性和形態(tài)

每只NASH 大鼠純化后獲得Kupffer 細(xì)胞數(shù)量為(1.5 ～2.0)×107個(gè)。取少量用胰蛋白酶消化后行Typan blue 染色，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在倒置相差顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定其活力均在95%以上。新鮮分離的Kupffer 細(xì)胞呈圓形，體積較小，約15 min 后開(kāi)始貼壁，3 h 后貼壁完全，部分細(xì)胞已伸出偽足，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Isolated rat Kupffer cells culfured for 3 h (×100).圖1 純化后的Kupffer 細(xì)胞

2 FCM 鑒定Kupffer 細(xì)胞

如圖2 所示，M1 為低濃度標(biāo)記峰標(biāo)志，F(xiàn)ITC 為異硫氰酸熒光素。以M1 起始點(diǎn)與橫坐標(biāo)做平行線，平行線左側(cè)表示陰性細(xì)胞，右側(cè)表示陽(yáng)性細(xì)胞，左圖應(yīng)用兔IgG 作為陰性對(duì)照，未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，右圖可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。Anti-Lysozyme 檢測(cè)Kupffer 細(xì)胞:共檢測(cè)細(xì)胞10 000 個(gè)，表達(dá)lysozyme 的細(xì)胞共9 018 個(gè)，占所有細(xì)胞比例為90.18%，即Kupffer 細(xì)胞純度為90.18%。

Figure 2. The purity of Kupffer cells identified by flow cytometer. Isolated kupffer cells positive for lysozyme were more than 90.18%.圖2 FCM 細(xì)胞鑒定結(jié)果

3 各組大鼠Kupffer 細(xì)胞IKKβ 和NF-κB p65 mRNA 表達(dá)

與正常組比較，模型組Kupffer 細(xì)胞IKKβ 和NF-κB p65 mRNA 明顯升高(P ＜0.01);與模型組比較，IKKβ mRNA 以高劑量綜合方組、健脾方組和疏肝方組降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01 或P ＜0.05)。NF-κB p65 mRNA 以高低劑量綜合方組、高劑量健脾方組和高劑量疏肝方組降低有顯著差異(P ＜0.01或P ＜0.05)，其中高劑量綜合方組和高劑量健脾方組降低趨勢(shì)最明顯，見(jiàn)表1、2。這提示NASH 的發(fā)生可能與Kupffer 細(xì)胞IKKβ 和NF-κB p65 mRNA 的高表達(dá)有關(guān)，而疏肝健脾方藥能不同程度降低其表達(dá)水平。

表1 Kupffer 細(xì)胞中IKKβ mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平Table 1. The expression of IKKβ mRNA in Kupffer cells in each group［median(minimum ～maximum).n=6)］

表2 Kupffer 細(xì)胞NF-κB p65 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平Table 2. The expression of NF-κB p65 mRNA in Kupffer cells in each group［median(minimum ～maximum).n=6)］

4 各組大鼠Kupffer 細(xì)胞IKKβ、p-IKKβ 和NF-κB p65 蛋白表達(dá)

與正常組比較，模型組Kupffer 細(xì)胞IKKβ、p-IKKβ 和NF-κB p65 蛋 白 表 達(dá) 均 顯著 升 高(P ＜0.01);與模型組相比，各藥物組IKKβ 蛋白表達(dá)都有不同程度降低(P ＜0.01 或P ＜0.05)，組間比較高劑量健脾方組優(yōu)于其它各組(P ＜0.01)，IKKβ 和p-IKKβ 表達(dá)由低到高依次為高劑量健脾方組﹤高劑量綜合方組﹤低劑量綜合方組﹤高劑量疏肝方組﹤低劑量疏肝方組﹤低劑量健脾方組。各用藥組NFκB p65 蛋白表達(dá)也明顯降低(P ＜0.01)，高劑量健脾方組較其它各組降低更明顯(P ＜0.01 或P ＜0.05)，見(jiàn)圖3 和表3。上述結(jié)果表明，NASH 模型Kupffer 細(xì)胞可能存在著IKKβ/NF-κB 信號(hào)通路蛋白的高表達(dá)及活化，而疏肝健脾方藥在一定程度上能降低上述蛋白表達(dá)水平及活化，以高劑量健脾效果最明顯高劑量。

Figure 3. Expression of IKKβ，p-IKKβ and NF-κB p65 proteins in Kupffer cells. 1:normal group;2:model group;3:Shu-gan(high dose)group;4:Shu-gan (low dose)group;5:Jian-pi (high dose)group;6:Jianpi (low dose)group;7:composite (high dose)group;8:composite (low dose)group.圖3 各組大鼠Kupffer 細(xì)胞IKKβ、p-IKKβ 和NF-κB p65蛋白的表達(dá)

表3 Kupffer 細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較灰度值比較Table 3. Expression of IKKβ，p-IKKβ and NF-κB proteins in Kupffer cells in each group (mean±SD. n=6)

討 論

NF-κB 是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)和免疫細(xì)胞活化、增殖、分化、凋亡及腫瘤的形成中發(fā)揮重要作用。能激活I(lǐng)κB 的一類蛋白被稱為IKK 復(fù)合物，是NF-κB 信號(hào)通路上游的調(diào)節(jié)蛋白，幾乎所有與NF-κB 激活有關(guān)的信號(hào)分子都要通過(guò)IKK 復(fù)合物介導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)［11］。研究表明，IKKα 和IKKβ 在NF-κB 信號(hào)通路的激活中發(fā)揮重要作用，尤其是IKKβ 在NF-κB 經(jīng)典信號(hào)通路活化中發(fā)揮尤為重要的作用［12］。

NF-κB 通過(guò)2 種途徑參與NASH 的發(fā)病。(1)TIR (Toll/interleukin-1 receptor，TIR)家族。蛋白被配體激活后，通過(guò)活化MyD88-TRAF6-TAK1，從而啟動(dòng)IKK-NF-κB 信號(hào)通路。(2)腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)家族。TNFR被配體激活后，發(fā)生三聚體化，與TNFR 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(TRADD)形成TNFR-TRADD 復(fù)合物，募集TNFR 相關(guān)因子2(TRAF2)和受體相關(guān)蛋白(RIP)，TRAF 使RIP 泛素化，通過(guò)與IKK 的IKKγ 亞基結(jié)合使IKK 集聚于TNFR 復(fù)合物，從而活化IKK-NF-κB信號(hào)通路［13-14］。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，NASH 模型組Kupffer 細(xì)胞IKKβ、NF-κB mRNA 及IKKβ、p-IKKβ、NF-κB 蛋白明顯升高，表明NASH 發(fā)病中可能存在著Kupffer 細(xì)胞IKKβ-NF-κB 信號(hào)通路的活化。與模型組比較，各用藥組Kupffer 細(xì)胞IKKβ mRNA 表達(dá)以高劑量綜合方組和高劑量健脾方組、高劑量疏肝方組降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NF-κB mRNA 表達(dá)以高低劑量綜合方組、高劑量健脾方組和高劑量疏肝方組降低明顯，IKKβ 及NF-κB mRNA 以高劑量綜合方組和高劑量健脾方組下降趨勢(shì)更明顯。與模型組比較，各用藥組IKKβ 及磷酸化蛋白表達(dá)都有不同程度下調(diào)，高劑量健脾方組IKKβ 蛋白表達(dá)水平下降更為明顯，表達(dá)趨勢(shì)和IKKβ mRNA 基本相同。各用藥組NF-κB 表達(dá)也明顯降低，高劑量健脾方組較其它各組降低更明顯。這提示高劑量健脾方組和高劑量綜合方組藥物在IKKβ 和NF-κB mRNA 及蛋白表達(dá)方面都有明顯的下調(diào)作用。隨著NASH 炎癥程度的不斷加深，Kupffer 細(xì)胞中可能存在著NF-κB 信號(hào)通路的激活，NASH 的發(fā)生可能是啟動(dòng)NF-κB 信號(hào)通路作用的結(jié)果，高劑量健脾方和高劑量綜合方藥物能起到很好的下調(diào)NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的作用，可能是其防治NASH 的重要機(jī)制之一。

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