都 娟 黃建萍 趙曉艷 王 碩 肖麗麗 張尼娜

Alport 綜合征(AS)是兒童期以血尿?yàn)槭装l(fā)癥狀起病的常見疾病，其發(fā)病機(jī)制為Ⅳ型膠原α 鏈基因突變導(dǎo)致的基底膜損傷，臨床表現(xiàn)以血尿、進(jìn)行性腎功能減退，伴有高頻感音神經(jīng)性耳聾和眼部異常為特征［1］。AS 發(fā)生率約為1/5 000，在兒童慢性腎功能衰竭中約占3.0%［2］。AS 最主要的遺傳方式為X 連鎖顯性遺傳，是由于COL4A5 基因突變所致，約占85%，其他遺傳方式為常染色體顯性或隱性遺傳，由COL4A3 和(或)COL4A4 基因突變引起，約占15%［3］。近年來，隨著基因診斷技術(shù)的開展，使大部分AS病例在基因水平得到了確診，但目前國內(nèi)尚無應(yīng)用外顯子捕獲-第二代測序技術(shù)來檢測兒童AS 基因突變的報(bào)道，本文采用該技術(shù)對2010 年11 月至2012 年6 月北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一兒童醫(yī)院(我院)符合AS 臨床診斷［4］患兒進(jìn)行相關(guān)基因檢測，并總結(jié)臨床特點(diǎn)，以期豐富AS 基因突變數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步提高對該病的認(rèn)識(shí)。

1 病例資料

1.1 倫理和知情同意 本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒由其父母簽署知情同意書同意采血進(jìn)行基因檢測。

1.2 臨床特征 表1 顯示，4 例臨床診斷AS 患兒均為男性，年齡6 ～8 歲，平均7 歲;病程0 ～5 年，平均2.25 年。均表現(xiàn)為鏡下或肉眼血尿，尿RBC 形態(tài)均提示腎小球性血尿。均表現(xiàn)為不同程度蛋白尿，其中例2 曾達(dá)腎病水平蛋白尿。目前4 例腎功能均正常，均進(jìn)行了腎穿刺活檢，光鏡和常規(guī)免疫熒光檢查未見特異病變，電鏡檢查顯示典型的AS 基底膜病變。例1 腎Ⅳ型膠原免疫熒光檢查顯示:α3鏈+ + +，α5 + +，例3 皮膚Ⅳ型膠原免疫熒光檢查顯示α5 +。4 例均接受了純音測聽檢測，其中例2 表現(xiàn)為高頻聽力區(qū)受損。4 例均接受眼裂隙燈和眼底檢查，例1 右側(cè)視網(wǎng)膜脫色素改變，余3 例正常。經(jīng)詢問病史，4 例患兒家族中均無終末期腎病(ESRD)成員，例2 和3 母親均有鏡下血尿(表1)。

表1 4 例AS 患兒的主要臨床資料Tab 1 Major clinical data of 4 patients with AS

1.3 COL4A5、COL4A4 和COL4A3 基因外顯子捕獲-第二代測序

1.3.1 文庫構(gòu)建 患兒及其母親采集靜脈血，提取基因組DNA(the QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen，Hilden，Germany)，合格的基因組DNA 被隨機(jī)打斷(Covaris)，純化長度200 ～250 bp 的片段;之后純化的DNA 利用T4 DNA連接酶、T4 phosphonucleotide kinase 和Escherichia coli DNA聚合酶Klenow 片段進(jìn)行末端修復(fù)，再按照Illumina 的操作說明在片段兩端加上A 堿基，最后在兩端加上接頭，加上接頭后的模板進(jìn)行磁珠純化。

1.3.2 雜交 已加接頭純化后的模板進(jìn)行捕獲前PCR，PCR 產(chǎn)物純化后與自主設(shè)計(jì)的人類基因芯片(Roche NimbleGen，Madison，USA)雜交68 ～72 h，目標(biāo)片段與磁珠結(jié)合被捕獲，而未雜交的片段被洗掉，洗脫后的目標(biāo)片段再進(jìn)行一次捕獲PCR。

1.3. 3 測序 捕獲片段PCR 產(chǎn)物利用Agilent 2100 Bioanalyzer 和ABI stepOne 進(jìn)行富集度檢測，通過質(zhì)控后的PCR 產(chǎn)物在Illumina HiSeq 2000 上進(jìn)行雙向各90 bp 高通量測序，測序數(shù)據(jù)利用Illumina 的軟件進(jìn)行分析處理。測序重復(fù)3 次。

1.4 COL4A5 基因突變結(jié)果 突變位點(diǎn)測序reads 比對圖發(fā)現(xiàn)4 個(gè)突變，即Gly132Glu、Gly1238Arg、Gly267Arg 和Gly1033Ser，均為純合突變。例1 COL4A5 基因第7 外顯子第395 位堿基鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，即c.395 G ＞A，導(dǎo)致GGA→GAA 密碼子的改變，使得第132 位氨基酸從甘氨酸(Gly)突變?yōu)楣劝彼?Glu)，即p.Gly132Glu，其母親不攜帶該突變(圖1A);例2 COL4A5 基因外顯子41 第3712 位堿基鳥嘌呤(G)突變?yōu)榘奏?C)，即c.3712 G ＞C，導(dǎo)致GGC→CGC 密碼子的改變，使得第1238 位氨基酸從Gly 突變?yōu)榫彼?Arg)，即p.Gly1238Arg，其母親攜帶該突變(圖1B);例3 COL4A5 基因第14 外顯子第799 位堿基鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，即c. 799 G ＞A，導(dǎo)致GGG→AGG 密碼子的改變，使得第267 位氨基酸從Gly 突變?yōu)锳rg，即p.Gly267Arg，其母親攜帶該突變(圖1C);例4 COL4A5 基因第35 外顯子第3097 位堿基鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，即c.3097G ＞A，導(dǎo)致GGU→AGU 密碼子的改變，使得第1033 位氨基酸從Gly 突變?yōu)榻z氨酸(Ser)，即p.Gly1033Ser，其母親不攜帶該突變(圖1D)。4 例確定為X 連鎖遺傳型，2 例為新生突變，2 例來源于母親。SIFT 和PolyPhen 軟件進(jìn)行蛋白功能預(yù)測均顯示為有害突變。

圖1 4 例AS 患兒及其母親COL4A5 基因突變結(jié)果Fig 1 Four pathogenic mutations of COL4A5 gene in the 4 families

經(jīng)檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫以上4 種突變均為新突變。4 種突變的千人頻率(千人計(jì)劃中93 個(gè)中國人測序樣本中關(guān)于此SNP 的頻率信息)和本地頻率(本地收集的＞100 個(gè)正常人測序樣本中關(guān)于此SNP 的頻率信息)均為0。

2 討論

AS 共有3 個(gè)致病基因，分別為COL4A5(51 個(gè)外顯子)、COL4A3(52 個(gè)外顯子)和COL4A4(48 個(gè)外顯子)，外顯子數(shù)目龐大且無突變熱點(diǎn)，采用傳統(tǒng)PCR 測序方法檢測突變耗費(fèi)大量的時(shí)間和人力。雖有學(xué)者通過取患兒皮膚標(biāo)本培養(yǎng)成纖維細(xì)胞應(yīng)用RT-RCR 測序方法來檢測COL4A5基因［5］，較快捷，但該方法的缺點(diǎn)是:①取皮膚組織會(huì)給患兒帶來痛苦;②在某些無義突變介導(dǎo)的mRNA 降解或外顯子大片段缺失等情況下可導(dǎo)致突變檢測失敗。因此，尋找一種簡潔、快速的AS 基因突變檢測方法，成為了醫(yī)學(xué)研究者努力的目標(biāo)。外顯子捕獲-第二代測序技術(shù)可在同一張芯片上高特異性和高覆蓋率捕獲研究者感興趣的目標(biāo)外顯子區(qū)域，利用第二代測序直接解析數(shù)據(jù)，篩選出突變。該方法只需6 個(gè)工作日即可完成，節(jié)省人力。因此，采用外顯子捕獲-第二代測序技術(shù)進(jìn)行AS 基因診斷，比傳統(tǒng)的PCR 測序法更為實(shí)用［6］。晚近，Artuso 等［7］用該技術(shù)對3 例疑似AS 患兒進(jìn)行了基因分析，發(fā)現(xiàn)2 例患兒分別于COL4A3 和COL4A4 基因發(fā)生復(fù)合雜合突變。目前國內(nèi)尚未見采用該技術(shù)進(jìn)行AS 研究的報(bào)道。

AS 是由于Ⅳ型膠原α 鏈基因突變導(dǎo)致的基底膜損傷，Ⅳ型膠原是構(gòu)成腎小球基底膜(GBM)的重要組成部分。Ⅳ型膠原由α1 ～α6 鏈構(gòu)成，分別由COL4A1 ～COL4A6 基因編碼表達(dá)［8］。COL4A5 基因位于Xq22 區(qū)域，全長250 kb，共51 個(gè)外顯子，編碼含1 685 個(gè)氨基酸的α5(Ⅳ)鏈，其中間膠原區(qū)(1 430 個(gè)氨基酸)為富含甘氨酸(Gly-X-Y)的三聯(lián)結(jié)構(gòu)［9］。甘氨酸側(cè)鏈體積最小，使得3 個(gè)甘氨酸殘基足能容進(jìn)緊密折疊的三螺旋內(nèi)部，若甘氨酸的位置被一個(gè)體積較大的氨基酸替代，異常折疊的三螺旋膠原分子對蛋白酶降解的敏感性明顯增加而易于被降解［10］。迄今，已報(bào)道400 多種COL4A5 基因突變，尚未見熱點(diǎn)突變報(bào)道。錯(cuò)義突變占30%，多數(shù)為發(fā)生于α5(Ⅳ)鏈的膠原區(qū)且為甘氨酸殘基的替代［11］。本研究中4 例AS 患兒突變均發(fā)生在COL4A5 基因，分別為Gly132Glu、Gly1238Arg、Gly267Arg和Gly1033Ser，均為甘氨酸被替代的錯(cuò)義突變，用SIFT 和PolyPhen 軟件進(jìn)行蛋白功能預(yù)測均為有害突變。有研究報(bào)道，發(fā)生在COL4A5 基因第23 ～51 外顯子突變的患者會(huì)較早進(jìn)入腎功能衰竭期，或更容易合并眼、耳的損害，但突變對α5 (Ⅳ)鏈蛋白功能影響尚待進(jìn)一步研究［12］。Gly132Glu 和Gly1033Ser 為新生突變，發(fā)生可能與以下因素有關(guān):①患兒在發(fā)育過程中受物理、化學(xué)和生物等因素的誘變作用所致;②患兒母親如生殖細(xì)胞發(fā)生新生突變則導(dǎo)致其表現(xiàn)為生殖細(xì)胞嵌合體，在受精卵形成過程中攜帶突變的卵細(xì)胞可能會(huì)將突變傳遞給下一代，傳遞概率由突變型生殖細(xì)胞占總生殖細(xì)胞的比例來決定［13］。雖然攜帶新生突變患兒的父母再生育該類患兒可能性很小，但是攜帶新生突變患者婚后再生育后代仍有遺傳風(fēng)險(xiǎn)，因此，新生突變患者婚后生育時(shí)有必要進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。

甘氨酸替代類型與臨床表型之間并無顯著的相關(guān)性。如COL4A5 錯(cuò)義突變，導(dǎo)致869 位的甘氨酸被精氨酸替代和α5(Ⅳ)鏈的1143 位的甘氨酸被門冬酰胺替代的AS 患者，臨床表現(xiàn)均較重［14，15］。但某些同樣發(fā)生于α(Ⅳ)鏈膠原區(qū)的甘氨酸替代卻產(chǎn)生較輕的臨床表現(xiàn)［16］。還有某些氨基酸替代并不導(dǎo)致Ⅳ型膠原分子的病理改變而出現(xiàn)臨床癥狀［17］。說明被替代甘氨酸的位置或者替代氨基酸本身都可以對三螺旋折疊產(chǎn)生影響，并最終影響其臨床表型的嚴(yán)重性。本文4 例患兒均為甘氨酸替代的突變，目前腎功能均正常，臨床表現(xiàn)差異不大，但疾病的發(fā)展和預(yù)后需要進(jìn)一步隨訪研究。

據(jù)報(bào)道，在X 連鎖顯性遺傳型AS，腎臟和皮膚Ⅳ型膠原免疫熒光染色大多數(shù)表現(xiàn)為α3(－)、α4(－)和α5(－)。而本文例1 和3 腎臟或皮膚Ⅳ型膠原免疫熒光染色均為(+)。復(fù)習(xí)文獻(xiàn)得知，有15% ～20%AS 患者腎組織α3、α4 及α5 鏈的分布可以正常［18］，如王芳等［19］報(bào)道了1 例7 歲AS 男性患兒，COL4A5 基因檢測顯示g.917G ＞A突變，而腎臟Ⅳ型膠原免疫熒光檢測α3、α4 及α5 鏈均陽性，皮膚α5 鏈均陽性，推測某些突變可能對α5 鏈的結(jié)構(gòu)和功能影響不大，因而不會(huì)導(dǎo)致Ⅳ型膠原檢測陰性。因此，對于AS 而言，臨床表型以及腎臟、皮膚的Ⅳ型膠原染色及電鏡檢查僅為診斷提供輔助信息，該病的確診最終依然靠基因診斷。

基因診斷是確診AS 的最可靠手段。本研究對4 例男性AS 臨床診斷患兒進(jìn)行了基因分析，最后證實(shí)突變均發(fā)生在COL4A5 基因上，早期基因診斷防止了誤診誤治，避免了激素及免疫抑制劑給患兒帶來的不良反應(yīng)。因此，對于疑似AS 患兒，尤其是男性，不論其母親是否有血尿，均建議首選COL4A5 基因檢測以明確診斷。目前關(guān)于COL4A5基因突變的功能研究仍是一個(gè)難點(diǎn)和熱點(diǎn)，本課題組將開始新突變功能研究，在蛋白水平研究基因突變對AS 的影響。

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