黃越燕， 肖 純， 尹滿香， 劉春花， 喬玉丹， 施 旻， 王曉敏， 徐優(yōu)慧

(1嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興314001;2江西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌330004;3武警浙江省總隊醫(yī)院病理科，浙江 嘉興314000)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMT)是婦科常見病，近年來其發(fā)病率逐年增加［1］。EMT 的發(fā)病原因及發(fā)病機制尚未清楚，故給治療帶來了一定的困難。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療本病多以藥物和手術(shù)為主，因其副作用明顯，復(fù)發(fā)率較高，常難以為患者接受。中醫(yī)藥治療子宮內(nèi)膜異位癥積累了豐富的臨床經(jīng)驗［2-4］。復(fù)宮寧是江西省中醫(yī)院臨床治療內(nèi)異癥的經(jīng)驗方，具有活血化瘀、通絡(luò)和消瘕散結(jié)之功，本實驗主要采用HE 染色、透射電鏡技術(shù)及免疫組化方法觀察復(fù)宮寧實驗組異位內(nèi)膜細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和凋亡蛋白表達的變化，并與模型組和達那唑治療組相比較，從凋亡的角度，以探討復(fù)宮寧制劑的作用及其機制。

材 料 和 方 法

1 藥品制備、試劑

復(fù)宮寧制劑由三棱、莪術(shù)、紅花、蒲黃、延胡、白芍、菟絲子、巴戟天等中藥經(jīng)水提法制成每mL 含生藥2 g，大鼠每天劑量1.0 g/kg 和2.0 g/kg。達那唑(danazol)膠囊:上海醫(yī)藥有限公司華聯(lián)制藥廠，產(chǎn)品批號為090801，用蒸餾水配成每mL 含膠囊25 mg。Caspase-3 和Bcl-2 抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 動物模型制作

健康雌性SD 大鼠，50 只，體重(200 ±50)g，由南昌大學(xué)實驗動物中心提供，在江西中醫(yī)學(xué)院病理實驗室完成實驗。實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)15 d，每天同一時間陰道涂片，觀察大鼠動情周期。在第3 個動情周期的動情期，采用自體子宮內(nèi)膜移植法［5］建立EMT 大鼠模型。以1%戊巴比妥鈉麻醉，開腹找到子宮，切下左側(cè)子宮角中段長約1 cm，行端對端吻合術(shù)。將剝離的子宮內(nèi)膜組織剪成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小的內(nèi)膜塊，縫合在左側(cè)子宮系膜，縫合切口。術(shù)后動物分籠單放，讓其自然蘇醒。常規(guī)飼養(yǎng)。

3 分組及給藥

造模4 周后取經(jīng)剖腹證實造模成功的大鼠40只，隨機分為4 組，即:復(fù)宮寧治療1 組、復(fù)宮寧治療2 組，達那唑治療組和模型組，每組10 只。其中復(fù)宮寧1 組和2 組分別按1.0 g·kg－1·d－1和2.0 g·kg－1·d－1給藥，達那唑組以100 mg·kg－1·d－1給藥，模型組給予等容量生理鹽水。每天1 次灌胃。持續(xù)給藥4 周。

4 儀器

SZK 型醫(yī)用超凈工作臺，PH140A 型培養(yǎng)箱/干燥箱，LXJ-64-01 型離心機，SZ-93 型自動雙重純水蒸餾器，BX-41 型光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)，Q550CW 圖像信息采集與分析系統(tǒng)等。

5 標本的采集與處理

于末次用藥24 h 后，剖腹，取下異位病灶，分離周圍黏連組織。取右側(cè)子宮中段(在位內(nèi)膜)1 cm和異位內(nèi)膜作為標本，置于10% 中性甲醛溶液和2.5%戊二醛中固定備用。移植物(異位病灶)成活標準:肉眼可見移植物增大，呈隆起的小泡狀，有些形成多房的囊腫，充滿黃色或清亮漿液，被結(jié)締組織覆蓋并有血管形成，部分移植物呈黃色或褐色小結(jié)。雙腳規(guī)測量移植物體積(長×寬×高)，單位mm3。以2.5%戊二醛固定的組織用于制作超微切片，透射電鏡觀察子宮內(nèi)膜細胞的凋亡情況。

6 異位和在位內(nèi)膜HE 染色及觀察

標本固定48 h 后取出，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(片厚3 ～4 μm)、脫蠟、水化，HE 染色觀察。

7 免疫組化法分析活化caspase-3 及Bcl-2 蛋白的表達

將在位、異位內(nèi)膜石蠟切片標本，進行免疫組化染色，采用SP 法染色，DAB 顯色。結(jié)果判定:采用H-score 法［6］，由兩位病理醫(yī)師雙盲觀察染色均勻的切片，每張切片隨機選擇5 個不同高倍視野(×400)觀察選擇在位、異位內(nèi)膜組織的被覆上皮所有細胞，記錄陽性染色(即胞質(zhì)或/和胞膜呈棕黃色)的細胞百分數(shù)并計分。 ＜5%的陽性細胞，計0 分;5% ～10%的細胞呈陽性，計1 分;11% ～50%的細胞呈陽性，計2 分;＞50%的細胞呈陽性，計3 分。細胞著色強度以多數(shù)陽性細胞呈現(xiàn)的染色(棕黃色)為強著色，計3 分;淡黃色為弱陽性，計1 分;兩者之間的黃色為中等著色，計2 分。將陽性細胞百分數(shù)計分和染色強度計分相加，為免疫組化積分(兩位醫(yī)師觀察結(jié)果如有不同，取二者計分之和的平均數(shù))。

8 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean ±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和SNK-q 檢驗，采用Spearman 等級相關(guān)分析檢驗caspase-3 及Bcl-2 蛋白表達的相關(guān)性，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 復(fù)宮寧對異位囊腫體積的影響

用藥前各組病灶體積無差異;用藥后，復(fù)宮寧與達那唑?qū)Υ笫螽愇粌?nèi)膜均具有明顯的抑制作用。復(fù)宮寧組病灶明顯縮小，與模型組和用藥前相比均有顯著差異(P ＜0.01);與達那唑組相比無顯著差異(P ＞0. 05)。達那唑組與模型組比病灶體積縮小(P ＜0.01)，與用藥前比病灶體積縮小(P ＜0.01)。模型組自身前后比較，體積不但無縮小，反而繼續(xù)生長(P ＜0.05)，說明病變在發(fā)展中，見表1。

表1 復(fù)宮寧對異位囊腫體積的影響Table 1. Effect of Fugongning on volume of ectopic cysts in rats with endometriosis(mm3.Mean±SD.n=10)

2 組織形態(tài)學(xué)變化

光鏡下模型組異位內(nèi)膜形成封閉的環(huán)形結(jié)構(gòu)，較在位內(nèi)膜薄，內(nèi)膜上皮為單層柱狀、立方狀，大部分上皮細胞有分泌現(xiàn)象(可見核下空泡)，可見薄層間質(zhì)和豐富的血管，有的見少量腺體或少量含鐵血黃素及中性粒細胞浸潤，見圖1。達那唑組異位、在位內(nèi)膜腺上皮層明顯變薄，細胞呈柱狀或低柱狀甚至扁平狀松散排列，細胞核不規(guī)則，位置不定，見圖2。復(fù)宮寧組異位內(nèi)膜上皮呈低柱狀、扁平狀，單層松散排列，部分病灶內(nèi)膜萎縮呈線狀或者內(nèi)膜脫落、消失。間質(zhì)細胞明顯減少，甚至缺如，周圍血管少。僅個別病灶內(nèi)見少量腺體。而在位的子宮內(nèi)膜則無明顯變化，上皮細胞、腺體及間質(zhì)細胞均無萎縮現(xiàn)象，見圖3。

Figure 1. Endometrial tissues in model group (HE staining，×200). A:endometriotic lesion，with high columnar epithelium and vascular hyperemia;B:cystic endometriotic lesion，with columnar glandular epithelium and inflammatory cells in the cavity;C:eutopic endometrium，with a few inflammatory cells infiltrating in glandular epithelium，and nondecreasing glands.圖1 模型組子宮內(nèi)膜組織

Figure 2. Endometrial tissues in danazol treatment group (HE staining，× 200). A:high-columnar glandular epithelial hyperplasia in endometriotic lesion around ovarian;B:glandular epithelial hyperplasia and inflammation being inhibited in endometriotic lesion;C:various degrees of atrophy in eutopic endometrial epithelium and glands.圖2 達那唑治療組子宮內(nèi)膜組織

Figure 3. Endometrial tissues in Fugongning treatment group(HE staining，×100). A:significantly-reduced endometriotic lesion，with little intracavitary secretion，and cyst wall fibrosis;B:atrophy and lowering in part of endometriotic epithelium，and cyst wall hemosiderosis;C:abundant glands in eutopic endometrium，with secretion but no atrophy.圖3 復(fù)宮寧治療組子宮內(nèi)膜組織

3 超微結(jié)構(gòu)改變

透射電鏡顯示:模型組異位內(nèi)膜上皮結(jié)構(gòu)完好，細胞界限清晰，有細纖毛和溶酶體，線粒體、高爾基體等細胞器。達那唑組異位內(nèi)膜上皮可見纖毛減少或消失，線粒體等細胞器結(jié)構(gòu)不清，部分上皮細胞凋亡。復(fù)宮寧組異位內(nèi)膜上皮胞體收縮，失去微絨毛，胞漿濃縮，核染色質(zhì)密度增高并凝聚于核膜周邊，核仁裂解;細胞膜內(nèi)陷和凋亡小體形成，見圖4。

Figure 4. Ultrastructual changes of endometrial epithilial cells. A:model group (×4 000);B:danazol treatment group (×4 000);C:Fugongning treatment 1 group (×4 000);D:Fugongning treatment 2 group (×8 000).圖4 子宮內(nèi)膜上皮細胞的超微病理學(xué)改變

4 活化caspase-3 蛋白表達特征

活化caspase-3 蛋白在各組在位、異位內(nèi)膜的腺上皮細胞和間質(zhì)細胞的胞質(zhì)中表達，呈不同程度黃色或棕黃色的顆粒，見圖5。陰性對照片中所有細胞均無著色。各組在位內(nèi)膜活化caspase-3 蛋白表達水平較一致(P ＞0.05);各組異位內(nèi)膜活化caspase-3蛋白表達水平不同，復(fù)宮寧1 組、2 組活化caspase-3蛋白表達明顯高于模型組(P ＜0.01)。復(fù)宮寧1 組、2 組在位內(nèi)膜活化caspase-3 蛋白表達水平明顯低于異位內(nèi)膜(P ＜0.01)，模型組和達那唑組在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜活化caspase-3 蛋白表達無顯著差異(P ＞0.05)，見表2。

Figure 5. Activated caspase-3 protein expression in endometrial tissues (immunohistochemical staining). A:low expression in ectopic endometrium from model group(×400);B:high expression in ectopic endometrium from Fugongning treatment group(×400);C:low expression in eutopic endometrium from Fugongning treatment group(×200).圖5 子宮內(nèi)膜組織活化caspase-3 蛋白的表達

表2 各組在位、異位內(nèi)膜活化caspase-3 蛋白表達水平的比較Table 2. Expression of activated caspase-3 protein in eutopic and ectopic endometrial tissues from different groups (mean±SD. n=10)

5 Bcl-2 蛋白表達特征

Bcl-2 蛋白主要表達于各組在位、異位內(nèi)膜的腺上皮細胞，主要在胞質(zhì)和胞膜表達，表現(xiàn)為不同程度黃色的顆粒，淋巴細胞和子宮平滑肌細胞可呈陽性表達，子宮內(nèi)膜間質(zhì)未見表達，見圖6。各組在位內(nèi)膜Bcl-2 蛋白表達水平較一致(P ＞0.05);各組異位內(nèi)膜Bcl-2 蛋白表達水平不同，復(fù)宮寧1 組、2 組Bcl-2 蛋白表達明顯低于模型組(P ＜0.01)。復(fù)宮寧1組、2 組異位內(nèi)膜Bcl-2 蛋白表達水平明顯低于在位內(nèi)膜(P ＜0.01)。模型組恰恰相反，異位內(nèi)膜Bcl-2蛋白表達水平明顯高于在位內(nèi)膜(P ＜0.05)。達那唑組異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜Bcl-2 蛋白表達水平無顯著差異(P ＞0.05)，見表3。

Figure 6. Bcl-2 protein expression in endometrial tissues (immunohistochemical staining，×200). A:high expression in ectopic endometrium from model group;B:low expression in ectopic endometrium from Fugongning treatment group;C:high expression in eutopic endometrium from Fugongning treatment group.圖6 子宮內(nèi)膜組織Bcl-2 蛋白的表達

表3 各組在位、異位內(nèi)膜Bcl-2 蛋白表達水平的比較Table 3. Expression of Bcl-2 protein in eutopic and ectopic endometrial tissues from different groups (mean ±SD. n =10)

6 各組異位內(nèi)膜Bcl-2 與caspase-3 表達的相關(guān)性

經(jīng)Spearman 等級相關(guān)分析，各組異位內(nèi)膜bcl-2蛋白的表達水平與caspase-3 蛋白的表達水平呈負相關(guān)(r=－0.377，P ＜0.05);而各組在位內(nèi)膜兩者的表達未顯示其相關(guān)性。

討 論

EMT 是具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外身體的其它部位引起的疾患，其臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、月經(jīng)失調(diào)、不孕、盆腔包塊等。病情反復(fù)，臨床難以根治。EMT 發(fā)病機制尚不完全清楚，目前多數(shù)學(xué)者認為，它可能是一種在免疫及細胞凋亡異?；A(chǔ)上發(fā)生經(jīng)血逆流而導(dǎo)致的綜合結(jié)果［7］，而凋亡是子宮內(nèi)膜細胞保持周期性結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的關(guān)鍵因素，異位內(nèi)膜細胞得以在宮腔外種植并繼續(xù)存活，與其對凋亡的抵抗力增強有關(guān)［8］。子宮內(nèi)膜入盆、腹腔后，在異位逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視而存活、種植，為EMT 的發(fā)病創(chuàng)造了有利條件。

中醫(yī)對內(nèi)異癥從病因病機、治法治則上形成了較完善體系并在一定程度上達成共識:認為多因外感寒熱濕邪，或內(nèi)傷七情及婦科宮腔手術(shù)創(chuàng)傷等所致，“瘀血阻滯胞宮、沖任”是其基本病機，治療上大多以活血化瘀為大法。針對內(nèi)異癥的病因病機，結(jié)合本院的臨床經(jīng)驗，確立以活血化瘀、消瘕散結(jié)為治療原則的復(fù)宮寧制劑，同時兼顧導(dǎo)致淤血內(nèi)阻的其它相關(guān)因素，理氣行血、散寒溫經(jīng)、補腎益精。三棱、莪術(shù)消癥散結(jié)，能減少盆腔黏連，化散囊腫、包塊等子宮內(nèi)膜異位病灶;紅花、蒲黃等活血通經(jīng)、散瘀止痛;佐以巴戟天、淫羊藿、菟絲子補腎益精、溫里散寒，使血得溫則行，瘀血得消;加入延胡、白芍行氣止痛，使氣行則血行。全方藥簡功專，組方合理，具有免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)凋亡的功能，有效縮小或消除異位病灶，緩解痛經(jīng)，改善月經(jīng)不調(diào)，還可能提高內(nèi)異癥伴不孕患者的受孕率。

本實驗采用經(jīng)典的手術(shù)移植自體子宮內(nèi)膜，建立EMT 模型，實驗結(jié)果表明模型組異位內(nèi)膜增生，產(chǎn)生局部黏連，提示造模成功;復(fù)宮寧2 個劑量組均有不同程度的抑制異位內(nèi)膜的增生，使其萎縮、退變、凋亡。本實驗觀察各組在位子宮內(nèi)膜均未見凋亡現(xiàn)象，模型組異位內(nèi)膜偶見凋亡細胞，這和文獻［9-12］報道一致。用復(fù)宮寧后，異位上皮細胞凋亡數(shù)明顯增多，與徐邦生等［13］研究消癥湯對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠異位內(nèi)膜細胞增殖和凋亡的結(jié)果一致。復(fù)宮寧組異位內(nèi)膜細胞凋亡現(xiàn)象明顯:電鏡下可見核染色質(zhì)邊聚成新月狀，有的凝集成塊狀，或形成凋亡小體。有的細胞胞漿中有較多的溶酶體和腫脹空泡變的線粒體。提示復(fù)宮寧的療效機制，一方面是其促進了異位內(nèi)膜上皮細胞的凋亡;另一方面，增多的溶酶體也可促進細胞的自溶;復(fù)宮寧致線粒體的空泡變性也十分明顯，必然引起細胞的能量代謝障礙，進一步使異位內(nèi)膜細胞的萎縮和變性，最終促進異位病灶縮小和消失。本研究還通過免疫組化觀察，發(fā)現(xiàn)在復(fù)宮寧組，EMT 大鼠異位內(nèi)膜腺上皮細胞Bcl-2 蛋白表達水平明顯低于其在位內(nèi)膜，但模型組中卻相反。復(fù)宮寧組大鼠異位內(nèi)膜腺上皮細胞caspase-3 蛋白的表達水平則明顯高于其在位內(nèi)膜，達那唑組中兩者相差不明顯。我們將各組異位內(nèi)膜Bcl-2 與caspase-3 表達的相關(guān)性經(jīng)Spearman 等級相關(guān)分析，各組異位內(nèi)膜Bcl-2 蛋白的表達水平與其caspase-3 蛋白的表達水平呈負相關(guān)(r =－0.377，P＜0.05);而在各組在位內(nèi)膜兩者的表達未顯示其相關(guān)性。由此可見，復(fù)宮寧通過激活細胞中的caspase酶原活性及降低Bcl-2 蛋白在EMT 中的高表達，誘導(dǎo)異位內(nèi)膜細胞的凋亡，而起到對異位內(nèi)膜的抑制作用。Harada 等［14］進行了EMT 在位及異位內(nèi)膜與正常女性子宮內(nèi)膜對凋亡敏感性的比較實驗發(fā)現(xiàn)，EMT 患者在位及異位內(nèi)膜對凋亡的敏感性均明顯下降，異位者較在位者下降更明顯，且無周期性變化，推測內(nèi)膜組織自發(fā)凋亡減弱和對凋亡的敏感性降低是EMT 發(fā)生的原因之一。本實驗中，復(fù)宮寧治療組異位內(nèi)膜有明顯凋亡現(xiàn)象，而在位內(nèi)膜無明顯凋亡，是否通過影響內(nèi)膜細胞對凋亡信號的敏感性不同來誘導(dǎo)細胞的凋亡，還有待于進一步研究探討。前期實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，復(fù)宮寧制劑能夠通過降低異位內(nèi)膜ER 和PR 的表達而起到抑制異位內(nèi)膜生長的作用［15］。我們觀察到，達那唑能有效降低EMT 大鼠血清E2和P 水平，復(fù)宮寧制劑也有輕度降低EMT 大鼠血清E2和P 的作用，模型組血清E2和P 含量明顯高于正常組，說明復(fù)宮寧可以通過抑制大鼠E2和P 的異常分泌達到治療EMT 的目的。復(fù)宮寧制劑兼顧活血補腎祛瘀，對病人從整體進行調(diào)節(jié)，而且毒副作用小，可以長期服用，減少復(fù)發(fā)率。復(fù)宮寧能誘導(dǎo)異位子宮內(nèi)膜細胞凋亡，與達那唑療效相似，其調(diào)控機制很可能與E2水平下降密切相關(guān)。但復(fù)宮寧降低E2 的作用不及達那唑，可能因此而具有保護正常子宮內(nèi)膜的作用。

［1］ 郎景和.子宮內(nèi)膜異位癥的基礎(chǔ)與臨床研究(第一卷)［M］. 第1 版.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2003:228-242.

［2］ 涂飛霞，阮 菲，吳瑞瑾，等.STAT3 和SOCS3 與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性研究［J］.中國病理生理雜志，2012，28(1):152-154，158.

［3］ 劉蓉蓉，曹保利，李繼坤. 補腎祛瘀法對子宮內(nèi)膜異位癥細胞凋亡的影響［J］.山西中醫(yī)，2008，24(10):54-56.

［4］ 鄒 杰，關(guān) 錚，張唯一，等. 散結(jié)鎮(zhèn)痛膠囊和達那唑?qū)Υ笫笞訉m內(nèi)膜異位癥治療效果的比較［J］. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32(8):1112-1116.

［5］ 肖 純，黃桂林，彭澤華，等.大鼠實驗性子宮內(nèi)膜異位癥模型復(fù)制［J］. 中國病理生理雜志，1995，11(3):333-334.

［6］ Ota H，Igarashi S，Sasaki M，et al. Distribution of cyclooxygenase-2 in eutopic and ectopic endometrium in endometriosis adenomyosis ［J］. Hum Reprod，2001，16(3):561-566.

［7］ Hastings JM，F(xiàn)azleabas AT. Future directions in endometriosis research［J］. Semin Reprod Med，2003，21(2):255-262.

［8］ Garcia-Velasco JA，Arici A. Apoptosis and the pathogenesis of endometriosis［J］. Semin Reprod Med，2003，21(2):165-172.

［9］ 王 曼，俞 瑾，錢祖淇.子宮內(nèi)膜異位癥、妊娠高血壓綜合征及女性不孕癥的中西醫(yī)結(jié)合診療標準［J］. 中西醫(yī)結(jié)合雜志，1991，11(6):376-379.

［10］Dmowski WP，Ding J，Shen J，et al. Apoptosis in endometrial glandular and stromal cells in women with and without endometriosis［J］. Hum Reprod，2001，16(9):1802-1808.

［11］ Braun DP，Ding J，Shen J，et al. Relationship between apoptosis and the number of macrophages in eutopic endometrium from women with and without endometriosis［J］.Fertil Steril，2002，78(4):830-835.

［12］高 穎，羅麗蘭，何福仙.異位子宮內(nèi)膜細胞的凋亡與增殖的研究［J］. 中華婦產(chǎn)科雜志，1999，34(9):536-539.

［13］徐邦生，朱建華，蔡云平，等. 消癥湯對子宮內(nèi)膜異位模型大鼠異位組織細胞增殖和凋亡的影響［J］.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2003，12(3):281-285.

［14］Harada T，Kaponis A，Iwabe T，et al.Apoptosis in human endometrium and endometriosis［J］. Hum Reprod Update，2004，10(1):29-38.

［15］喬玉丹，張曉春，周志愉，等. 復(fù)宮寧對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜雌、孕激素受體表達和動情周期的影響［J］. 時珍國醫(yī)國藥，2010，21(11):2743-2744.