張譯文， 羅海華， 張 旭， 張 輝， 劉 超

(中山大學(xué)人類(lèi)病毒學(xué)研究所，熱帶病防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510080)

人類(lèi)免疫缺陷病毒1 型(human immunodeficiency virus 1，HIV-1)感染導(dǎo)致的艾滋病療法(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是本世紀(jì)威脅人類(lèi)健康的重大傳染病。目前，國(guó)際上多采用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretroviral therapy，HAART)治療艾滋病。HAART 可在短期內(nèi)將病毒載量控制在較低的水平，改善艾滋病患者的生存質(zhì)量，但不能完全清除體內(nèi)病毒，需終身服藥，且HAART費(fèi)用昂貴，有嚴(yán)重的副作用，易耐藥［1］。隨著我國(guó)HIV-1 感染人數(shù)的日益增加，亟待研發(fā)新的行之有效的抗病毒治療方法。

近年來(lái)，利用免疫細(xì)胞過(guò)繼治療的方法成為了HIV-1 臨床治療的一大熱點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)特異性T 淋巴細(xì)胞對(duì)艾滋病患者的病毒清除和免疫重建療效顯著［2］。人體內(nèi)的特異性T 淋巴細(xì)胞分為CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞。CD4+T 細(xì)胞通過(guò)提呈抗原并介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫。T 淋巴細(xì)胞分為3 個(gè)亞群，初始T 淋巴細(xì)胞、效應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞及記憶性T 淋巴細(xì)胞［3］。而記憶性T 細(xì)胞則又可以根據(jù)是否具有快速的效應(yīng)功能和表達(dá)相應(yīng)的歸巢受體C-C 趨化因子受體7(C-C chemokine receptor 7，CCR7)和L-選擇素(L-selectin，CD62L)劃分為2 個(gè)功能亞群:中央記憶性(central memory T cells，TCM)和效應(yīng)記憶性T 細(xì)胞(effector memory T cells，TEM)［4-7］。在HIV-1 病毒感染過(guò)程中，雖然記憶性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在清除HIV-1 病毒方面發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，但是TEM 在病毒控制上效果更為顯著［8］。由于TEM 細(xì)胞在T 細(xì)胞的總數(shù)中占的比例非常小，用傳統(tǒng)的體外擴(kuò)增方法難以獲得。維生素C(vitamin C，VC)作為一種小分子藥物，最早在臨床上用于壞血病的治療，其抗氧化作用被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，VC 在抑制腫瘤生長(zhǎng)［9-10］上發(fā)揮了一定的作用，并且可高效地維持干細(xì)胞的存活和自我更新［11-12］。為了在體外獲得大量的CD4+TEM，提高過(guò)繼免疫治療的效果，本研究首次利用VC 在體外成功地促進(jìn)了CD4+TEM 的大量擴(kuò)增。

材 料 和 方 法

1 材料

人的外周成分血由廣州市血液中心提供，隨機(jī)選取了10 份健康人的血液。主要試劑:RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于Invitrogen;胎牛血清購(gòu)于Gibco;VC 購(gòu)于Sigma;淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津?yàn)?yáng)生物制品有限責(zé)任公司;流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體anti-CD4-PE、anti-CD27-FITC、anti-CCR7-PECY5 和5，6-羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺脂(5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)購(gòu)于BD;anti-CD45RAECD 購(gòu)于Beckman;CD4+T 細(xì)胞陰性選擇磁珠購(gòu)于BD;CellTiter 96 AQueous One Solution 試劑盒購(gòu)自Promega。

2 儀器

倒置生物顯微鏡(Leica)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)、臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5810R)、生物安全柜(Thermo Scientific)、流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)和磁珠分選磁力架(BD Pharmigen)。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞分離 將外周成分血與PBS(含2% BSA和0.5% EDTA)按1∶4 混合均勻;然后將稀釋后的成分血液以1∶1 比例緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液的上方;1 450 r/min 離心45 min;小心吸取單核細(xì)胞，加入另一離心管中，用5 倍體積的PBS(含0.5% BSA和2% EDTA)稀釋?zhuān)旌暇鶆蚝螅?00 × g 離心15 min;重復(fù)上一步驟1 次;孵育CD4+T 細(xì)胞陰選試劑I 抗，15 min;用10 倍體積的PBS(含0.5% BSA 和2% EDTA)稀釋?zhuān)?00 ×g 離心15 min;磁珠II 抗孵育，30 min;進(jìn)行過(guò)柱細(xì)胞分選，得到CD4+T 細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640 重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞至所需濃度。

3.2 培養(yǎng)條件 將5 ×106cells/well CD4+T 細(xì)胞置于1 mL 含10%胎牛血清的RPMI-1640 中培養(yǎng)。在5% CO2、飽和濕度及37 ℃下進(jìn)行。

3.3 添加VC 及細(xì)胞因子 將分離好的CD4+T 細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并分為2 組;每組均以5 ×106cells /well鋪于12 孔板中，每孔加入anti-CD3、anti-CD28、IL-7和IL-15;在實(shí)驗(yàn)組的每孔細(xì)胞中額外加入不同濃度的VC(50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L 和125 mg/L)。

3.4 細(xì)胞亞群分析及細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)第0 天、10 天和15 天，吸取培養(yǎng)孔中的細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù);再將細(xì)胞，300 ×g 離心15 min，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，孵育檢測(cè)CD4+TEM 的流式抗體(CD45RA、CD27 和CCR7)30 min;加入5 倍體積的PBS 稀釋?zhuān)?00 ×g 離心10 min 洗掉流式抗體，加入PBS 重懸至需要的細(xì)胞密度，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均為同一供體的CD4+T細(xì)胞。從CD4 陽(yáng)性(F 區(qū)域)和CD45RA 陰性(L 區(qū)域)的細(xì)胞中選取CD27 與CCR7 雙陰性的細(xì)胞(J3區(qū)域)，即為所要觀察的CD4+TEM，見(jiàn)圖1。

3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖 從分選得到的不同供體的CD4+T 細(xì)胞中吸取細(xì)胞5 ×105個(gè)，300 ×g 離心15 min，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，孵育檢測(cè)增殖的流式抗體CFSE 30 min，細(xì)胞嚴(yán)格避光培養(yǎng)5 d，加入PBS 洗滌細(xì)胞2 次，稀釋到使用濃度，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均為同一供體來(lái)源的CD4+T 細(xì)胞。

Figure 1. Detection of CD4 + TEM by flow cytometry. A:prepared cells were gated with E region;B:prepared cells were stained for CD4 and regated with F region from E region to get CD4-positive cells;C:prepared cells were staining for CD45RA and regated with L region from E region to get CD45RA-negative cells;D:prepared cells were stained for CCR7 and CD27，and regated with J3 region from F and L regions to get CCR7 - CD27 - cells.圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4 + TEM

3.6 MTS 法測(cè)定細(xì)胞活性 將分離好的CD4+T 細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并分為2 組;每組均以1 ×105cells /well鋪于96 孔板中，每孔加入anti-CD3、anti-CD28、IL-7和IL-15;在實(shí)驗(yàn)組的每孔細(xì)胞中加入100 mg/L VC，培養(yǎng)15 d 之后，每孔加入20 μL MTS［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl )-5-(3-carboxymethoxyphenyl )-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt］溶液，在5%CO2、飽和濕度及37 ℃下孵育3 h 后測(cè)定490 nm 吸光度(absorbance，A)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 分析軟件。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較使用t 檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 VC 對(duì)于CD4+ T 細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增效果的檢測(cè)

VC 處理第10 天對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量為(9.29 ±0.81)×106;加50 mg/L VC 的細(xì)胞數(shù)量為(9.43 ±0.41)×106;加75 mg/L VC 的細(xì)胞數(shù)量為(9.13 ±0.76)×106;加100 mg/L VC 的細(xì)胞數(shù)量為(9.21 ±0.15)×106;加125 mg/L VC 的細(xì)胞數(shù)量為(8.75 ±0.16)×106。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行CFSE 檢測(cè)，表示增殖的陽(yáng)性峰在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間沒(méi)有差異。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，VC 對(duì)于CD4+T 細(xì)胞的總量擴(kuò)增沒(méi)有顯著影響，見(jiàn)圖2。

Figure 2. Effect of VC on CD4 + T cell amplification.A:CD4 + T cells were treated with 500 μg/L anti-CD3，500 μg/L anti-CD28，1 mg/L IL-7 and 1 mg/L IL-15，and cultured for 10 days with different concentrations (50 mg/L，75 mg/L，100 mg/L and 125 mg/L)of VC. Cells were analyzed by cell counter. B:CD4 + T cells were stained with CFSE and subsequently activated and expanded with or without VC (50 mg/L)for 5 days.The mean CFSE fluorescence of CD4 + T cells was measured by flow cytometry. Mean±SD. n=10.圖2 VC 對(duì)CD4 + T 細(xì)胞擴(kuò)增的影響

2 VC 對(duì)CD4+ TEM 在CD4+ T 細(xì)胞中所占比例的影響

在CD4+T 細(xì)胞中，CD4+TEM 的比例隨著VC濃度的增加而逐漸增加。對(duì)照組CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中占13.10%;VC 50 mg/L 組CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中占17.9%;VC 75 mg/L 組CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中占27.6%;VC 100 mg/L 組CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中占38.6%;VC 125 mg/L 組CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中占30.1%。上述結(jié)果表明，VC 對(duì)于CD4+TEM 細(xì)胞的比例擴(kuò)增作用在低于100 mg/L 的情況下存在劑量依賴(lài)的趨勢(shì)，并且100 mg/L 是促進(jìn)TEM 細(xì)胞比例增加的最佳濃度，見(jiàn)圖3。

Figure 3. Effect of different concentrations of VC on the proportion of CD4 + TEM in CD4 + T cells.CD4 + T cells were cultured with indicated treatments for 10 days. Mean±SD.n=10.圖3 VC 對(duì)CD4 + TEM 細(xì)胞比例的影響

3 VC 對(duì)CD4+ TEM 數(shù)量的影響

100 mg/L VC 處理細(xì)胞后，第0 天，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量為均1 ×105;第10 天，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量為(1.23 ±0.15)×106，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量為(3.56±0.35)×106;第15 天，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量為(1.85 ±0.75)× 106，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量為(5.47 ± 0.11)×106，見(jiàn)圖4。選取擴(kuò)增效果達(dá)到最高點(diǎn)(第15 天)的2 組CD4+TEM 細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較，對(duì)照組為(1.85±0.75)×106，實(shí)驗(yàn)組為(5.47 ±0.11)×106，2 組間細(xì)胞數(shù)量差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

Figure 4. Effect of VC on CD4 + TEM number at different time points. Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control at the same time point.圖4 VC 對(duì)CD4 + TEM 數(shù)量的影響

4 VC 對(duì)細(xì)胞活性的影響

100 mg/L VC 處理細(xì)胞后，第15 天對(duì)照組的吸光度值為0.715 ±0.010，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值為0.676±0.010，兩組間沒(méi)有顯著差異，見(jiàn)圖5。

Figure 5. Effect of VC on CD4 + T cell viability. CD4 + T cells were treated with 100 mg/L VC. After 15 days of culture，the cell viability was tested by MTS assay.Mean±SD.n=3.圖5 VC 對(duì)細(xì)胞活性的影響

討 論

T 細(xì)胞的體外擴(kuò)增一直是免疫過(guò)繼治療的一大熱點(diǎn)，目前一些研究者使用人工抗原來(lái)提呈細(xì)胞，在體外提高T 細(xì)胞的增殖并用于過(guò)繼治療，但是此技術(shù)成本高且尚無(wú)法保證臨床治療的安全性［13］。在本研究中，我們首次利用小分子藥物VC 促進(jìn)CD4+TEM 細(xì)胞在體外的擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)組中，CD4+T 細(xì)胞的總數(shù)沒(méi)有明顯變化;但較之對(duì)照組，其CD4+TEM 細(xì)胞的比例在CD4+T 細(xì)胞中顯著升高;通過(guò)對(duì)CD4+TEM 數(shù)量的檢測(cè)，在實(shí)驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)CD4+TEM 細(xì)胞數(shù)量顯著增多。

T 細(xì)胞的免疫過(guò)繼治療當(dāng)中，如果大量的過(guò)繼轉(zhuǎn)移T 細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生過(guò)激反應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們找到了在T 細(xì)胞總數(shù)不變的情況下，將大量初始T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+TEM 細(xì)胞的方法。實(shí)驗(yàn)中我們也進(jìn)一步找出了VC 可促進(jìn)CD4+TEM 在體外擴(kuò)增的最適濃度:VC 100 mg/L。我們發(fā)現(xiàn)，使用較低劑量的VC處理細(xì)胞后，CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中的比例上升存在顯著的劑量依賴(lài)趨勢(shì);而當(dāng)VC 的濃度達(dá)到125 mg/L 時(shí)，CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中的比例上升的效果卻開(kāi)始明顯下降(圖3)，這可能是由于藥物濃度過(guò)大使得細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生了較大改變從而影響了細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)選取VC 處理細(xì)胞10 d 以后進(jìn)行計(jì)數(shù)和檢測(cè)是由于在外周血中CD4+TEM 的起始數(shù)量非常少，CD4+T 細(xì)胞需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能在anti-CD3 與anti-CD28 共同刺激下逐漸形成較多的CD4+TEM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明選擇培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間后進(jìn)行檢測(cè)可獲得更好的效果(圖2、4)。同時(shí)，我們采用MTS 法對(duì)使用最佳擴(kuò)增濃度100 mg/L 的VC 刺激細(xì)胞15 d 的細(xì)胞活性進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在490 nm 處的吸光度值沒(méi)有顯著差異(圖5)。由此也證明，使用100 mg/L VC 在體外長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)增TEM 細(xì)胞不會(huì)使細(xì)胞活性受到損害。

VC 作為一種抗氧化劑，無(wú)毒副作用，易獲得，作為常用的小分子藥物具有較高的生物安全性，廣泛用于臨床醫(yī)療［14-15］。VC 對(duì)CD4+TEM 的體外擴(kuò)增作用可作為新型的過(guò)繼免疫治療方式用于艾滋病的臨床治療當(dāng)中，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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