王朝元，易繼凌，宋 超，魏甜甜，唐俊龍，楊光忠

(1 中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074；2中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074)

接骨草(Sambucuschinensis)為忍冬科接骨木屬，又名陸英、杜仲.主要分布于華北、華南、陜西、甘肅、四川、寧夏等省區(qū).接骨草的根、莖、葉、花和果實(shí)均可入藥，有祛風(fēng)除濕、活血化瘀之功效.在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中，它可治療風(fēng)濕疼痛、痢疾、黃疸、慢性氣管炎、風(fēng)疹瘙癢、丹毒、跌打損傷和骨折[1，2]，目前關(guān)于接骨草防治骨質(zhì)疏松和促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的報(bào)道較多[3]，但其促進(jìn)骨折愈合的有效成分尚不清楚.

綠原酸(chlorogenic acid ,CGA)是接骨草的化學(xué)成分之一，通常存在于杜仲、金銀花、葵花籽粕等植物中[4，5].現(xiàn)有研究表明：CGA具有廣泛的生理活性和藥理活性，如利膽、抗菌、降壓、增加白血球和興奮中樞系統(tǒng)，抗腫瘤，清除自由基等[6-8].故本實(shí)驗(yàn)以成骨細(xì)胞MC3T3-E1為體外模型，研究CGA對(duì)成骨細(xì)胞活性、ALP活性和成骨分化相關(guān)基因的影響，以闡明其是否具有促成骨作用，為接骨草的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

CGA(SIGMA-ALDRICH公司)，α-MEM培養(yǎng)基(Thermo賽默飛世爾生化制品有限公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，0.25％的胰蛋白酶(Thermo)，青鏈霉素(Thermo)，DMSO(Amresco，0231)，MTT(Amerro)，堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，BCA蛋白試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)，SYBR Green熒光染料(日本TOYOBO公司).

細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)，96孔、24孔、6孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)，CO2培養(yǎng)箱(HF90/240型，利康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán))，倒置顯微鏡(Motic AE21型，重慶光學(xué)儀器)，酶聯(lián)免疫分析儀(MULTISKAN ASCENT 354型，thermo)，PCR儀(Biometra)，凝膠成像分析儀(JS-380A，上海培清科技)，熒光定量PCR儀(ABI，7500 fast).

1.2 不同濃度CGA的制備

稱取0.05g CGA溶于50 mL α-MEM培養(yǎng)基(無血清)，配制成濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液.再用含10％血清的α-MEM培養(yǎng)基將CGA儲(chǔ)備液倍比稀釋為11.02,22.05,44.09,88.19μmol/L等處理細(xì)胞.

1.3 成骨細(xì)胞 MC3T3-E1的培養(yǎng)

取液氮凍存的成骨細(xì)胞MC3T3-E1復(fù)蘇后，用含有10％胎牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3～4d更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞90％鋪滿瓶底時(shí)，用0.25％的胰蛋白酶消化，按1︰2傳代培養(yǎng).

1.4 CGA對(duì)成骨細(xì)胞增殖率的影響

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板中，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞貼壁后，分別加入含上述濃度CGA的培養(yǎng)基，設(shè)不加藥為對(duì)照組，每組5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)0,1,3 d后，每孔分別加入20 μL MTT，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，反應(yīng)4 h，小心吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，吹打均勻后，在37℃培養(yǎng)箱中溫育10 min，使其紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值.

1.5 CGA對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的成骨細(xì)胞MC3T3-E1按105/孔接種到24孔板中，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待細(xì)胞貼壁后加入22.05,44.09 μmol/L藥物(該濃度下對(duì)成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)作用較好)設(shè)不加藥為對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)2,4,6 d后，按照ALP試劑盒和BCA蛋白試劑盒的操作步驟測(cè)定細(xì)胞中ALP活性.

1.6 CGA對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞按2×105/孔接種到6孔板中，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待細(xì)胞貼壁后加入藥物，設(shè)不加藥為對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)2,4,6 d后，用Trizol法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并進(jìn)行real-time PCR.反應(yīng)條件：95℃，15s；60℃，15s；72℃，45s；40個(gè)循環(huán).以看家基因GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用2﹣ΔΔCt法[9]檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)，不同骨相關(guān)基因PCR引物序列如見表1.

表1 熒光定量PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

根據(jù)公式F=2﹣[(待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct值)-(對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct值)],計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量.用單因素方差分析(one-way ANOVA)對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 CGA對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

不同濃度CGA對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見圖1.如圖1所示，CGA濃度為11.02～88.19μmol/L時(shí)，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖均有較好的促進(jìn)作用，選擇22.05，44.09 μmol/L兩個(gè)濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1)control；2～5)依次為11.02，22.05，44.09，88.19μmol/L CGA

2.2 CGA對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性的影響

CGA對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性的影響見圖2.由圖2可見，培養(yǎng)2 d時(shí)，44.09 μmol/L的CGA能促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1ALP活性的表達(dá)(P<0.01).培養(yǎng)4 d時(shí)，CGA對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1ALP活性無顯著影響(P>0.05).隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)至6d時(shí)，22.05、44.09 μmol/L CGA對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性的影響具有抑制作用(P<0.05).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

2.3 CGA對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

CGA對(duì)c-fos基因mRNA表達(dá)的影響見圖3.由圖3可見，培養(yǎng)2d時(shí)，2種濃度的CGA對(duì)c-fos基因的表達(dá)均有極顯著促進(jìn)作用(P<0.01)；4d時(shí)，44.09 μmol/L CGA對(duì)c-fos基因表達(dá)的影響逐漸由促進(jìn)轉(zhuǎn)為抑制(P<0.05)；6d時(shí)，22.05 μmol/L CGA對(duì)c-fos基因表達(dá)明顯抑制(P<0.01)，呈時(shí)間依賴性.

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

CGA對(duì)c-jun基因表達(dá)的影響見圖4.由圖4可見，22.05 μmol/L CGA短期處理(2～4 d)不影響c-jun基因表達(dá)(P>0.05),長(zhǎng)期處理(6 d)則表現(xiàn)為抑制作用(P<0.05).44.09 μmol/L CGA處理2 d可顯著促進(jìn)c-jun基因表達(dá)(P<0.01)，長(zhǎng)期處理(4～6 d)則具有顯著的抑制作用(P<0.01).故CGA對(duì)成骨細(xì)胞c-jun基因表達(dá)亦呈明顯的時(shí)間依賴性.

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA 與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，n=3

CGA對(duì)Runx2基因表達(dá)的影響見圖5.由圖5可見，其影響呈明顯的時(shí)間依賴性.22.05 μmol/L CGA培養(yǎng)2～4d時(shí)，對(duì)Runx2 基因的表達(dá)呈上調(diào)作用(P<0.01)，至6 d時(shí)，則表現(xiàn)為強(qiáng)烈的抑制作用(P<0.01).44.09 μmol/L的CGA在短期處理(2d)時(shí)，顯著促進(jìn)Runx2 基因的表達(dá)(P<0.01)，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，促進(jìn)作用變成抑制(P<0.01)或沒有顯著影響(P>0.01).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

如圖6所示，CGA對(duì)osterix基因表達(dá)的影響也具有明顯的時(shí)間依賴性.兩種濃度的CGA短期處理(2 d)時(shí)，均極顯著地促進(jìn)Osterix基因的表達(dá)(P<0.01).隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加(4～6 d)，兩種濃度的CGA處理對(duì)成骨細(xì)胞osterix表達(dá)的促進(jìn)作用顯著減弱，直至抑制作用(P<0.01).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

如圖7顯示，與CGA對(duì)ALP基因表達(dá)的影響與osterix基因類似，也具有明顯的時(shí)間依賴性.培養(yǎng)2 d，2種濃度的CGA均促進(jìn)ALP基因的表達(dá)(P<0.05)； 4～6 d時(shí)，2種濃度的CGA對(duì)ALP基因的表達(dá)均具有不同程度的抑制(P<0.05).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

圖8中CGA對(duì)Col-I基因表達(dá)的影響也呈明顯的時(shí)間依賴性.但與CGA對(duì)Osterix和ALP基因表達(dá)的影響相反，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CGA對(duì)Col-I基因表達(dá)的促進(jìn)作用增強(qiáng).在2～6 d，22.05 μmol/L CGA對(duì)Col-I基因表達(dá)的影響由抑制轉(zhuǎn)為促進(jìn)(P<0.01)；而44.09 μmol/L的CGA對(duì)Col-I基因表達(dá)的影響始終具有促進(jìn)作用(P<0.05)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，促進(jìn)作用愈發(fā)顯著(P<0.01).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

3 討論

MC3T3-E1細(xì)胞系是由C57BL/6小鼠顱骨細(xì)胞建株的成骨細(xì)胞，具有堿性磷酸酶活性，I型膠原合成和基質(zhì)鈣化等成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性，常作為骨代謝研究的細(xì)胞模型[10].故本研究以MC3T3-E1細(xì)胞系來探討CGA對(duì)成骨細(xì)胞增殖及活性的影響.

本實(shí)驗(yàn)中，11.02～ 88.19 μmol/L的CGA在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)成骨細(xì)胞的增殖均具有一定的促進(jìn)作用，以22.05,44.09 μmol/L的CGA在2個(gè)濃度的CGA進(jìn)行進(jìn)一步研究.

ALP的表達(dá)是成骨細(xì)胞分化早期的主要特征之一，是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志，其活性的高低可反映成骨細(xì)胞的活性狀況[11].故本文研究了CGA對(duì)ALP活性的影響.在2～6 d，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，22.05 μmol/L CGA對(duì)ALP活性的影響由不影響變?yōu)橐种疲?4.09 μmol/L CGA對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性的影響則由促進(jìn)變?yōu)橐种?，并與隨后的CGA對(duì)ALP基因表達(dá)的影響結(jié)果一致.說明CGA對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性的調(diào)控主要通過對(duì)其mRNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控來實(shí)現(xiàn).

Runx2是干細(xì)胞向成骨細(xì)胞早期分化的重要標(biāo)志基因，高表達(dá)Runx2可激活骨鈣蛋白、骨橋蛋白和骨涎蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟[12].Osterix是一種成骨細(xì)胞特異性表達(dá)的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)成骨細(xì)胞的分化起著重要作用.Osterix轉(zhuǎn)錄受Runx2正性調(diào)控,直接促進(jìn)前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化.Osterix能調(diào)控許多重要成骨細(xì)胞晚期表型和功能蛋白的表達(dá),如骨鈣蛋白、骨橋蛋白、骨涎蛋白及I型膠原[13].在本研究中，CGA對(duì)Runx2和Osterix基因的表達(dá)具有顯著的時(shí)間依賴性，短期處理可以促進(jìn)Runx2和OsterixmRNA的表達(dá)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，則表現(xiàn)為抑制作用.這一結(jié)果說明CGA短期處理可能促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，而長(zhǎng)期處理則不利于干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化.

十分有意義的是，CGA可以促進(jìn)成骨細(xì)胞Col-I的表達(dá).I型膠原蛋白是成骨細(xì)胞分泌的骨主要有機(jī)成分，是成骨細(xì)胞的分化標(biāo)志之一[14].本實(shí)驗(yàn)中，除了短期培養(yǎng)(2 d)時(shí)，低濃度(22.05μmol/L)的CGA對(duì)Col-I基因的表達(dá)具有一定抑制作用(P<0.05)，4～6 d，CGA均能顯著促進(jìn)Col-I基因的表達(dá)，并呈時(shí)間依賴性.說明合適濃度的CGA對(duì)成骨細(xì)胞成熟具有正向調(diào)控作用，有助于骨基質(zhì)的形成和骨生長(zhǎng).

原癌基因c-fos產(chǎn)物與其他一些轉(zhuǎn)錄因子如c-jun表達(dá)的癌蛋白結(jié)合，形成活性蛋白-1(AP-1)，進(jìn)而調(diào)控其他基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致一系列生物學(xué)效應(yīng)的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖[15].在成骨細(xì)胞中，c-jun調(diào)控相關(guān)基因如骨鈣素、I型膠原、堿性磷酸酶和組蛋白轉(zhuǎn)錄[16],故c-jun是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖分化的基因之一.本研究中，CGA對(duì)c-fos和c-jun表達(dá)影響具有一定的復(fù)雜性，尚需進(jìn)一步的研究闡明其機(jī)理.

綜上所述，CGA具有調(diào)控成骨細(xì)胞增殖和分化的能力，CGA可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，抑制成骨細(xì)胞ALP活性；CGA長(zhǎng)期處理不利于干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，它通過促進(jìn)I型膠原的表達(dá)而促進(jìn)骨成熟分化.故CGA具有一定的成骨活性，是接骨草的成骨活性成分之一.

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