詹建立， 辛 麗， 孫 燕

(葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究實驗室 喀什師范學(xué)院生地系，喀什 844006)

伽師瓜(Jiashimuskmelon)屬于葫蘆科(Cutrbitaceae)黃瓜屬(CucumisL.)甜瓜亞屬(MeloJeffrey)的一個甜瓜品種，因其源于新疆喀什地區(qū)伽師縣而得名。近年來，有很多學(xué)者對甜瓜病害進行了研究。目前，全世界已發(fā)現(xiàn)的引起甜瓜采后病害的病原菌有20余種[1]。導(dǎo)致中國甜瓜貯期病害的主要病原菌為鏈格孢菌(Alternariaalternata)、青霉菌(Penicilliumspp.)、粉紅單端孢菌(Trichotheciumroseum)和鐮刀菌(Fusariumsp.)。其中，粉紅單端孢菌和鐮刀菌是常溫下發(fā)生病害的主要病原菌，鏈格孢菌和青霉菌是冷藏條件下發(fā)生病害的主要病原菌[2-4]。此外，問亞軍等人對渭南早春拱棚甜瓜的細(xì)菌性角班病、枯萎病和霜霉病等主要病害的綜合防治技術(shù)進行了研究[5]。新疆大學(xué)的李冠教授在甜瓜免疫性的誘導(dǎo)和抗病基因的克隆等領(lǐng)域也取得了較大的進展[6-9]。

在甜瓜的病害研究中，對伽師瓜的研究也較多?？讘c軍等人主要對伽師瓜的抗病基因進行了研究[10， 11]。張有林等人研究了伽師瓜采后生理和貯期病害，并探討了貯藏保鮮技術(shù)。其結(jié)論是：伽師瓜為呼吸躍變型果實，貯期病害黑斑病病原菌為叢梗孢科(Moniliaceae)青霉屬(PenicilliumLK,ex Fries)的鮮綠青霉(P.viridicatumWestling)。TBZ熏蒸和殼聚糖涂膜對PPO、POD、PE酶活性和病原菌抑制作用顯著[12]。伽師縣克孜勒博依鄉(xiāng)農(nóng)技站的阿迪力·吐爾遜等人對伽師瓜白粉病、霜霉病等病害的常規(guī)防治技術(shù)進行了探討[13]。另外， 新疆農(nóng)科院植保所在喀什地區(qū)和阿勒泰地區(qū)建立了甜瓜病害監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，建成了甜瓜霜霉病預(yù)測和控制的計算機技術(shù)分析平臺[14]。

本研究對伽師瓜生長和貯藏期間病瓜上的微生物進行了初步的分類鑒定，并通過細(xì)菌學(xué)檢測和Koch法則驗證初步推斷了伽師瓜可能的病原菌。這將為伽師瓜的病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 伽師瓜病瓜的采集

采集生長和貯藏期間的伽師瓜病瓜。

1.1.2 主要試劑

PCR preMix、EDTA-Na2、Tris、CTAB、EB、SDS和Agarose等購自大連寶生物有限公司(TaKaRa)。16S rRNA和18S rRNA引物由上海捷瑞生物責(zé)任有限公司合成，回收DNA使用TaKaRa公司的the Gel Extraction Mini Kit (50次)。

1.2 方法

1.2.1 微生物的分離

樣品采集后制備樣品懸液：用75%的酒精擦洗病變的伽師瓜瓜皮，然后用無菌水沖洗數(shù)次，在無菌條件下選取病瓜病灶部位并放入95 mL無菌水中，振蕩10 min，制成稀釋度為10-1的菌懸液。取200 μL樣品稀釋液涂布接種于牛肉膏培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基平板上，分別于37℃和28℃培養(yǎng)。

1.2.2 微生物總DNA的提取

取分離得到的微生物單個菌落進行16S rRNA 和18S rRNA 基因序列分析。細(xì)菌總DNA的提取按照CTAB法進行[15]。用改良 CTAB 法提取霉菌總DNA[16]。酵母總DNA的提取按照文獻[17]進行。

1.2.3 病原菌16S/18S rRNA基因的擴增

將染色體DNA作為PCR擴增的模板。DNA擴增反應(yīng)(25 μL反應(yīng)體系)：9.5 μL無菌水，1 μL引物1，1 μL引物2，12.5 μL rTaq酶和1 μL模板DNA。PCR反應(yīng)條件：細(xì)菌：94 ℃，30 s；55℃，30 s；72℃，2 min。真菌： 94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，2 min。霉菌：94℃，30 s；53℃，30 s；72℃，2 min。

1.2.4 病原菌16S rRNA和18S rRNA基因克隆的產(chǎn)物純化

用DNA膠回收試劑盒對克隆基因進行回收和純化。

1.2.5 病原菌16S rRNA和18S rRNA基因測序

擴增產(chǎn)物直接進行測序，委托北京奧科鼎盛有限責(zé)任公司測序。

1.2.6 病原菌16S rRNA和18S rRNA基因序列分析

測序結(jié)果通過http://www.ncbi.nih.nlm.gov網(wǎng)站進行BLAST序列比對。同時，利用Mega 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.7 病原菌常規(guī)細(xì)菌學(xué)及Koch假說測定

將伽師瓜幼苗進行土培，接種時先用70%的酒精對幼苗葉片表面消毒，然后用針蘸取在培養(yǎng)的菌體懸液針刺和涂抹接種，各個菌株分別接3片幼苗葉片，每片幼苗葉片接種2個部位，以無菌水作對照。接種后逐日觀察發(fā)病情況。待發(fā)病后，從發(fā)病幼苗葉片進行病原菌再分離，以進行柯赫氏法則實驗，獲得的純培養(yǎng)分離菌株用于進行微生物學(xué)性狀測定。

1.2.8 病原菌的生理生化

明膠液化實驗、甲基紅實驗、油脂水解試驗、淀粉水解試驗、果聚糖產(chǎn)生試驗、接觸酶實驗和葡萄糖氧化發(fā)酵實驗按照文獻[18]進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 伽師瓜微生物的分離

通過平板稀釋涂布法，本研究從伽師瓜病瓜中初步分離得到2株細(xì)菌、3株酵母菌和8株霉菌。

2.2 伽師瓜病原菌總DNA的提取

本研究對伽師瓜病瓜上分離到的可能病原菌提取了總DNA(見圖1)。

圖1 伽師瓜病原菌總DNA的提取電泳圖

2.3 伽師瓜病原菌16S rRNA和18S rRNA的擴增

伽師瓜病原細(xì)菌的16S rRNA序列擴增結(jié)果表明，從伽師瓜病瓜上分離的細(xì)菌1、細(xì)菌2、細(xì)菌3和細(xì)菌4的16S rRNA片段得以擴增，且片段大小約為1500 bp(如圖2)。

伽師瓜病原霉菌的18S rRNA序列擴增結(jié)果表明，從伽師瓜病瓜上分離的霉菌1～10的18S rRNA片段得以擴增，且片段大小約為500～750 bp之間(如圖3)。

圖2 伽師瓜病瓜分離細(xì)菌的16S rRNA基因電泳圖

圖 3 伽師瓜病瓜霉菌基因組的電泳圖

圖4 伽師瓜病瓜酵母基因組的電泳

伽師瓜病原酵母的18S rRNA序列擴增結(jié)果表明，從伽師瓜病瓜上分離的酵母1～10的18S rRNA片段得以擴增，且片段大小約為500～750 bp之間(如圖4)。

2.4 伽師瓜病原菌16S rRNA和18S rRNA的測定

擴增片段經(jīng)純化后由北京奧科鼎盛有限公司測序，其中測出的可比對序列有2株細(xì)菌、8株霉菌和3株酵母菌。

圖5 伽師瓜病瓜分離菌株16S rRNA 和18S rRNA基因進化樹

2.5 伽師瓜病原菌16S rRNA和18S rRNA的序列分析

本研究從伽師病瓜上分離到的B2細(xì)菌與Pantoeasp.Enrichmentcultureclone(EU784083)在同一個分支上，同時其與Enterobactercloacae(HQ179578)在一個大分支上。因此可以初步推斷B2細(xì)菌可能隸屬于泛菌屬(Pantoea)或腸桿菌屬(Enterobacter)，前者是農(nóng)作物的致病菌之一(見圖5)。

因此，本研究對從伽師病瓜上分離到的B2、B4、M1、M5、M6、M7、M10、M11、M12、M13、Y3、Y14和Y15等13株菌株進行16S rRNA全基因序列和18S rRNA基因部分序列分析。結(jié)果表明，B2可能隸屬于泛菌屬或腸桿菌屬，B4可能隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，M1可能隸屬于畢赤酵母屬(Pichia)，M11和M12可能隸屬于酵母菌屬(Pichia)或白假絲酵母屬(Candida)，M5、M7和M10青霉屬(Penicillium)，M6可能隸屬于正青霉屬(Eupenicillium)，M13可能隸屬于地霉屬(Galactomyces)，Y3和Y14可能隸屬于酵母屬(Candida)，Y15可能隸屬于真菌(fungus)。

因為泛菌屬、酵母菌屬或白假絲酵母屬和地霉屬均是果蔬的致病菌，因此，本研究初步推斷伽師瓜生長和貯藏期間的可能病原菌是B2、M1、M11、M12、Y3和Y14。

2.6 伽師瓜病原菌的科赫法則驗證和宿主確定

通過對伽師瓜病瓜樣品進行分離純化后獲得的上述13個分離菌株分別進行伽師瓜、甜瓜和油白菜幼苗葉片離體針刺涂抹接種。8～16 d后，伽師瓜可能病原菌B2、M1、M11、M12、Y3和Y14接種后的伽師瓜和甜瓜植株葉片周圍部分發(fā)黃、萎蔫、植株出現(xiàn)倒伏而對照植株幼苗沒變枯黃，且生長良好。再次對分離到的伽師瓜和甜瓜枯黃、萎蔫的幼苗葉片的病原菌進行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)與最初獲得的分離菌株形態(tài)相同。因此，再次推測B2、M1、M11、M12、Y3和Y14是伽師瓜的可能病原菌。同時也推測伽師瓜可能是這幾株可能病原菌的宿主，而油白菜不是其宿主。

2.7 伽師瓜病原菌的生理生化實驗

本研究對伽師瓜病原菌進行了明膠液化、甲基紅試驗、油脂水解、淀粉水解、果聚糖產(chǎn)生實驗、接觸酶實驗和糖發(fā)酵實驗等生理生化實驗。結(jié)果表明，僅有B4、M1和M10菌株能夠液化明膠，B2、M7、M13、Y3、Y14甲基紅實驗呈陽性，M1、M6、M12、M13、Y3和Y14水解油脂，M1、M6、M13、Y14和Y15產(chǎn)果聚糖，B2、M11、Y14和Y15接觸酶反應(yīng)不產(chǎn)氣泡呈陰性，B4、M5、M10、Y14和Y15發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，B4、M5、M7、M10、M13、Y3、Y14 和Y15能夠水解淀粉(見表1)。

表1 伽師瓜病原菌的生理生化實驗

3 討論

本研究從貯藏期的伽師瓜病瓜上分離到了13株菌株，通過16S rRNA全基因序列 和18S rRNA部分基因序列分析，初步確定了可能的病原菌為B2、M1、M11、M12、Y3和Y14。通過生理生化分析得出：在生長和儲藏期間，使伽師瓜致病的細(xì)菌為產(chǎn)酸型、且在生活狀態(tài)中，表現(xiàn)出不能產(chǎn)生分解蛋白質(zhì)、淀粉和油脂的胞外酶。另外，伽師瓜致病的主要病源菌是霉菌和酵母菌。這可能和伽師瓜的含糖量高的特性有關(guān)。

通過本研究的結(jié)果，可以有三點啟示：一是利用這些致病菌的某些特性，象生化特性，如M1和Y14都能夠產(chǎn)生果聚糖，而果聚糖是對人身體有益的成分，所以，如果能夠變這些致病菌為提高伽師瓜品質(zhì)的有益菌是很有意義的嘗試。二是從分子生物學(xué)角度思考，根據(jù)這些致病菌的基因序列和生化特性，進行轉(zhuǎn)基因甜瓜抗病品種的研究，開發(fā)伽師瓜體內(nèi)的抗性基因，以對抗致病菌的生物化學(xué)特性，使其不能存活，從而達到提高其抗病能力的目的。目前，這方面的研究比較多，諸如對蔗糖合成酶編碼基因的相關(guān)研究[19， 20]。三是在推動本土微生物的基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上，建立瓜類品種微生物致病菌庫，給果蔬的微生物學(xué)防治提供平臺。

[1]蔣賢權(quán),王 偉,唐建輝,等. 甜瓜采后擬莖點霉菌腐爛病及其生物防治[J]. 植物保護學(xué)報,2007,34(2): 129-135.

[2]Bi Y,Tian S P,Lui H X,et al. Effect of temperature on chilling injury,decay and quality of Hami melon during storage[J]. Postharvest Biology and Technology,2003,29: 229-232.

[3]楊 渡,李廣闊,馬俊義,等. 伽師縣甜瓜主要流行性病害發(fā)生與分析[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,(2): 73-75.

[4]毛曉英,吳慶智,劉曉航,等. 新疆哈密瓜采后主要致腐病原真菌的分離與鑒定[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報,2006,12(12): 120-121.

[5]問亞軍,郝平琦,萬會萍,等. 早春茬拱棚甜瓜病害綜合防治技術(shù)[J]. 西北蔬菜,2011,6:35-36.

[6]王賢磊,高興旺,張鐵鋼,等. 甜瓜抗病基因同源序列的克隆與分析[J]. 新疆大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,2: 136-144.

[7]王賢磊,李 群,方 勇.單核苷酸多態(tài)性與甜瓜抗枯萎病分子育種研究[J]. 生物技術(shù),2007,4: 1-3.

[8]李金玉,顏 雪,黃 瓊,等.甜瓜抗枯萎病基因同源序列克隆與序列分析[J]. 生物技術(shù). 2006,3: 3-9.

[9]李金玉,李 冠,趙惠新,等. 甜瓜抗霜霉病基因同源序列克隆與分析[J]. 植物生理學(xué)通訊. 2006,3: 435-440.

[10]孔慶軍,任雪艷. 祝建波. 新疆伽師瓜高效再生系統(tǒng)建立及抗真菌病基因轉(zhuǎn)化[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,2: 207-217.

[11]孔慶軍,任雪艷. 祝建波,等. 抗病基因轉(zhuǎn)化新疆伽師瓜研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,1: 67-70.

[12]張有林,張潤光,孫 剛,等. 伽師瓜采后生理、貯期病害及貯藏保鮮技術(shù)[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,6: 1220-1228.

[13]阿迪力·吐爾遜,阿依古麗·那曼,怕熱達姆·哈里克. 甜瓜病害常規(guī)防治技術(shù)[J]. 農(nóng)村科技,2011,3: 6-7.

[14]韓 盛. 新疆甜瓜霜霉病預(yù)測與控制的技術(shù)推廣”通過驗收[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,4: 749-750.

[15]Saito H,Miura K. Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment[J]. Biochin Biophys Acta ,1963,72: 619-629.

[16]可小麗,汪建國,顧澤茂,等. 水霉菌總 DNA提取方法研究[J]. 水生生物學(xué)報,2008,32(1): 68-73.

[17]Kurtzman CP,Robnett CJ,Yarrow D. Three new species ofCandidafrom apple cider:C.anglica,C.cidriandC.pomicola[J]. Antonie VAn Leeuwenhoek,2001,(80): 237-244.

[18]東秀株,蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京: 科學(xué)出版社,2001.

[19]Wen X,Zhang W,Feng Y,et al. Cloning and characterization of a sucrose synthase-encoding gene from muskmelon[J].Molecular Biology Reprots,2010,37(2): 695-702.

[20]Tian H,Ma L,Zhao C,et al. Antisense repression of sucrose phosphate synthase in transgenic muskmelon alters plant growth and fruit development[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2010,393 (3): 365-370.