李 浩， 黃媛媛， 李 曼， 宋水山

(1. 河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津300130； 2. 河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊050051；3. 河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，石家莊050081)

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是微生物在非平衡生長(zhǎng)(如碳源過(guò)剩，氮氧、磷、鐵等營(yíng)養(yǎng)缺乏)條件下在胞內(nèi)積累的碳源和能源儲(chǔ)存物質(zhì)，具有生物降解性和生物相容性，是替代化學(xué)常規(guī)塑料的理想材料，也在生物醫(yī)學(xué)方面極具應(yīng)用前景[1]。PHA是一類(lèi)由3-羥基脂肪酸組成的線性聚酯，根據(jù)組成PHA單體的碳鏈長(zhǎng)度可以把PHA分為兩大類(lèi)：短鏈PHA和中長(zhǎng)鏈PHA。短鏈PHA單體主要由3～5個(gè)碳原子組成，其材料性質(zhì)與化學(xué)塑料聚丙烯較為接近。中長(zhǎng)鏈PHA的單體主要由6～14個(gè)碳原子組成，其材料性質(zhì)與橡膠、彈性纖維較為接近。最近研究發(fā)現(xiàn)，如果在聚-3-羥基丁酸[P(3HB)]的骨架中插入少量的中長(zhǎng)鏈的單體，可以合成像聚乙烯那樣的低密度材料[2-8]。

PHA生物合成過(guò)程主要涉及兩個(gè)反應(yīng)步驟：一是利用各種代謝分子合成單體羥?；o酶A (3-hydroxyacyl-CoAs,HA-CoAs)；二是PHA聚合酶使HA-CoAs聚合生成PHA。聚-3-羥基脂肪酸酯因具有生物可降解性、光學(xué)活性、抗紫外輻射、生物相容性等許多優(yōu)點(diǎn)而被研究最為廣泛。但P(3HB)易脆，柔軟度差，后期加工性能差。為了促進(jìn)PHA的商業(yè)化，滿足不同應(yīng)用領(lǐng)域?qū)Σ牧闲阅艿囊螅枰铣删哂胁煌阅艿腜HA。PHA聚合酶的活性、底物特異性以及微生物代謝途徑?jīng)Q定著PHA的單體組成，進(jìn)而影響著PHA的理化特性和材料性能。本文將概述PHA合成酶分子改造和PHA合成代謝工程方面的研究進(jìn)展，并討論含稀有單體PHA的合成。

1. PHA合成酶的分類(lèi)及改造

根據(jù)PHA合成酶的亞基構(gòu)成和底物特異性的差異，PHA合成酶大致可以分為I、 II、 III和IV等4類(lèi)。I、II類(lèi)PHA合成酶只有一個(gè)PhaC亞基。I類(lèi)PHA合成酶可以利用短鏈HA-CoAs為底物，而II類(lèi)的PHA聚合酶可以利用短鏈HA-CoAs，也可以利用長(zhǎng)鏈HA-CoAs為底物[9,10]。III類(lèi)PHA合成酶由PhaC和PhaE兩個(gè)亞基組成，其亞基末端序列與I類(lèi)、II類(lèi)的PHA合成酶具有一定的同源性，例如PhaC亞基與I類(lèi)、II類(lèi)相比存在20%～30%的同源性。III類(lèi)PHA合成酶對(duì)短鏈的HA-CoAs具有很高的特異性，但是在一些假單胞菌中它也可以聚合中長(zhǎng)鏈的HA-CoAs合成PHA[11]。IV類(lèi)PHA合成酶由PhaC和PhaR兩個(gè)亞基組成，主要存在于芽孢桿菌中[12,13]。如圖1所示，不同類(lèi)型的PHA合成酶利用不同種類(lèi)的HA-CoAs作為底物聚合生成含有不同單體的PHA。

不同類(lèi)型的PHA合成酶具有不同的底物特異性。一般來(lái)說(shuō)，PHA合成酶對(duì)短鏈HA-CoAs的選擇性強(qiáng)，而對(duì)長(zhǎng)鏈HA-CoAs的選擇性較差。如要生物合成含有中長(zhǎng)鏈脂肪酸單體和短鏈脂肪酸單體的共聚物，尚需要發(fā)掘新的天然PHA合成酶或?qū)μ烊籔HA合成酶進(jìn)行定向分子改造。

圖1 不同種類(lèi)的PHA合成酶的亞基組成及其底物特異性

Matsusaki等首先發(fā)現(xiàn)來(lái)自于假單胞菌Pseudomonassp. 61-3中的PHA合成酶可以利用聚合短鏈的單體也可以聚合中長(zhǎng)鏈的單體，在以葡萄糖酸鈉為唯一碳源培養(yǎng)時(shí)，合成由C4、C6、C8、C10和C12的3HA單體組成的PHA。其合成酶基因phaC1和phaC2的氨基酸序列與P.oleovorans和P.aeruginosa的PHA合成酶基因有較高的同源性，并且Pseudomonassp. 61-3的合成酶基因phaC1和phaC2之間的同源性也達(dá)到了53.2%[14]。Amara等人發(fā)現(xiàn)Aeromonascaviae中的PHA合成酶也可以高效聚合3HB-CoA和3HHx-CoA兩種單體，產(chǎn)生P(3HB-co-3HHx)。A.caviae的PHA合成酶的基因與Acinetobactersp和R.eutropha的PHA合成酶的同源性較高，分別為45.1%和42.7%[15]。Kesaven等人發(fā)現(xiàn)的Chromobacteriumsp. USM2的PHA合成酶可以同時(shí)聚合3HB、3HHx和3HV，并且它的酶活是同屬的其他菌酶活的8倍左右。把USM2的合成酶基因插入到大腸桿菌中，以葡萄糖為碳源培養(yǎng)24 h后，P(3HB)的累積量可達(dá)細(xì)胞干重的(76±2)%[16]。Chung等人研究發(fā)現(xiàn)P.entomophilaL48積累的PHA中由4種單體組成，其中3HD占38.6mol%、3HO占44.5mol%[17]。

在對(duì)PHA合成酶的分子改造方面，Matsumoto等人在Pseudomonassp. 61-3 PHA合成酶中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)(Glu130、Ser325、Ser477、Gln481)，它們可以使聚合酶在特異性聚合3HB-CoA同時(shí)也不影響對(duì)中長(zhǎng)鏈3HA-CoA單體的聚合活性。這4個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變，明顯提高了P(3HB)的合成，與野生型相比，大約提高了340～400倍。更重要的是當(dāng)這些氨基酸位點(diǎn)發(fā)生改變時(shí)，可以使大多數(shù)Pseudomonas中的II類(lèi)PHA合成酶聚合3HB-CoA[18]。利用Pseudomonas中II類(lèi)的PHA合成酶或者突變過(guò)的酶已成功的合成出了P(3HB-co-3HA)的共聚物，其中3HB單體的含量超過(guò)95 mol%。

Amara等人對(duì)A.punctata的PHA合成酶進(jìn)行隨機(jī)突變，從200000個(gè)突變體中篩選PHA合成酶活性提高的突變體，其中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)單突變體F518I和V214G可以提高合成酶的胞外活性至原來(lái)的2～5倍，但是PHA的積累量只提高7%～20%[19,20]。暗示PHA合成酶的胞外活性與PHA的積累量可能沒(méi)有必然的聯(lián)系。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在這些突變體中，所合成的PHA的分子量也有所增加，但是聚合物中單體3HB和3HHx的摩爾分?jǐn)?shù)沒(méi)有明顯的改變。同樣在A.caviae中另外兩個(gè)PHA合成酶突變體N149S和D171G中，合成酶的胞外活性提高了21%～56%， PHA的積累量與野生型相比提高了6.5倍，并且聚合物中3HHx所占的摩爾分?jǐn)?shù)也提高了10%～18%。在對(duì)A.caviae的進(jìn)一步研究中，利用N149S和D171G兩個(gè)位點(diǎn)的雙突變體NSDG研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在以辛酸鈉為碳源時(shí)，產(chǎn)生的PHA聚合物中3HO單體占0.4mol%，而3HHx占18.1mol%[21,22]。以果糖為碳源時(shí)可以使合成的P(3HB)的平均分子量達(dá)到3.68×106Dr。

Xue等人對(duì)Pseudomonasstutzeri1317的PHA合成酶的密碼子及mRNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化，利用添加的發(fā)卡結(jié)構(gòu)增加了mRNA的穩(wěn)定性[23]。優(yōu)化后的合成酶基因?qū)氪竽c桿菌，發(fā)現(xiàn)與未優(yōu)化的合成酶相比，優(yōu)化后的重組大腸桿菌中PHB的積累量提高了16倍。當(dāng)以十二烷酸鹽為碳源時(shí)，可以合成由3HB和中長(zhǎng)鏈單體3HA單體組成的共聚物P(3HB-co-3HA)，并且比原來(lái)的積累量提高了4倍。

2 PHA合成的代謝工程

4HB的引入可以顯著改善P(3HB)的材料性能，因此，P(3HB-co-4HB)的生物合成受到了廣泛關(guān)注[24]。Hein等人把R.eutropha的PHA合成酶基因和C.kluyveri的CoA轉(zhuǎn)移酶基因插入到大腸桿菌中，此重組后的大腸桿菌在含有葡萄糖和4HB的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以合成得到P(4HB)的均聚物。但在培養(yǎng)基中只加入4HB時(shí)，合成的PHA為P(72mol%3HB-co-28mol%4HB)。說(shuō)明存在未知的代謝途徑可以把4HB轉(zhuǎn)化為3HB，而葡萄糖的存在可能抑制了這種轉(zhuǎn)化。

如果想直接利用葡萄糖為碳源合成4HB-CoA，就需要其他酶的參與。Valentin等人研究發(fā)現(xiàn)三種重要的酶：琥珀酸半醛脫氫酶、4-羥基丁酸脫氫酶和CoA轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)它們的作用可以從葡萄糖中合成4HB-CoA，如圖2所示。在重組的大腸桿菌里利用上述的方法成功合成了P(3HB-4HB),但是因?yàn)閱误w4HB只占2.8mol%，所以還不足以影響整個(gè)材料的性質(zhì)。Li后來(lái)在此方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，阻止琥珀酸半醛轉(zhuǎn)化為琥珀酸鹽，可以把PHA中4HB單體的比例提高到11mol%。如果在培養(yǎng)基中補(bǔ)充α-酮戊二酸或者檸檬酸，可以使PHA中4HB的比例提高到20%[25]。宋水山等構(gòu)建的重組質(zhì)粒，可以利用TCA中間代謝產(chǎn)物合成出4HB單體，利用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌可以合成純的P(4HB)[26]。

Valentin等人在合成含有3HP的PHA中也是采用了類(lèi)似合成P(3HB-4HP)的方法。他們?cè)诖竽c桿菌里導(dǎo)入了R.eutropha的PHA合成酶和Salmonella enterica serovar Typhimurium的丙酰-CoA合成酶(PrpE)兩個(gè)基因。當(dāng)此重組的大腸桿菌在含有3HP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，就可以合成共聚物P(3HB-3HP)[27]。

Fukui等人在R.eutropha中也建立一種可以合成P(3HP-3HP)的代謝途徑。攜帶丙二酰-CoA還原酶和3HP-CoA合成酶基因的重組R.eutropha可以利用一些結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)的碳源如果糖或是脂肪酸來(lái)合成P(3HP-3HP)，其中單體3HP所占的比例為2.1mol%[28]。最新研究出的合成含有3HP的PHA的代謝途徑是把C.butyricum的甘油脫氫酶、S.enterica的丙醛脫氫酶和R.eutropha的PHA合成酶基因整合到大腸桿菌中，重組后的大腸桿菌以甘油為碳源培養(yǎng)，可以生成P(3HP)，占總的聚合物質(zhì)量的11.98%[29]。

圖2 在重組的E.coli中PHA合成的代謝途徑

為了能在生產(chǎn)P(3HB-3HA)的過(guò)程使用一些結(jié)構(gòu)不相關(guān)的碳源如：糖類(lèi)、脂肪酸或油類(lèi)物質(zhì)，有必要開(kāi)發(fā)出新的代謝途徑，既能大量合成中長(zhǎng)鏈的3HA-CoAs單體，又能合成特定單體比例的聚合物。以前的研究結(jié)果表示大部分的 P(3HB-3HA)中，除了P(3HB-3HHx)都很難準(zhǔn)確地控制聚合物單體間的比例。不過(guò)在最新研究中，Gao等人通過(guò)新構(gòu)建的代謝途徑，利用重組的惡臭假單胞菌(P.putida)可以生產(chǎn)出中長(zhǎng)鏈單體的均聚PHA，而利用這種新構(gòu)建的代謝途徑，有可能控制合成的P(3HB-3HA)中單體的比例[30-32]。最近對(duì)P.putidaKT2442的研究發(fā)現(xiàn)，可以生產(chǎn)出一系列中長(zhǎng)鏈單體聚合而成的PHA均聚物。Wang等人構(gòu)建的重組E.coliXL1-Blue中，把P.resinovorans的PhaC1基因及其它一系列基因?qū)肫渲?，?dāng)在含有乳酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)可以產(chǎn)生PLA的均聚物，若以癸酸或者正十二烷酸為碳源培養(yǎng)時(shí)，則可以分別合成聚3-羥基癸酸和聚(3-羥基癸酸-84mol%3-羥基十二烷酸)。

Yang等人為了聚合3HV單體，在大腸桿菌中插入了丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(pct)以及R.eutropha的PHA合成酶等基因。其中丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶可以高效的合成丙酰輔酶A進(jìn)而合成出3HV單體。合成此重組后的大腸桿菌可以合成出P(HB-co-HV)，并且3HV單體占總聚合物質(zhì)量的80%以上[33]。

3 生物合成含有2-羥基酸的PHA

Tsuji等人研究發(fā)現(xiàn)，PHA中的2-羥基丁酸(2HB)單體可以形成立體絡(luò)合結(jié)構(gòu)，可以顯著提高PHA的熱學(xué)性能和材料性能[34]。目前在自然界中，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可以合成含有2-羥基脂肪酸(2-HA)單體PHA的細(xì)菌。因此需要研究出可以合成含有2-羥基脂肪酸單體PHA的代謝途徑和PHA合成酶。

Han等人在對(duì)I、II、III和IV類(lèi)的PHA合成酶進(jìn)行大量的篩選后發(fā)現(xiàn)，R.eutrophaH16的PHA合成酶可以合成含有2HB單體的PHA共聚物，并且聚合過(guò)程要以3HB-CoA為起點(diǎn)，得到聚合物為P(3HB-9mol% 2HB)。但在目前的研究中，還不能合成出均聚物P(2HB)。

Matsumoto等人構(gòu)建的重組大腸桿菌LS5218，導(dǎo)入了Pseudomonassp 61-3 PHA合成酶的突變基因、M.elsdenii的Pct基因和P.aeruginosa的烯酰-CoA水合酶基因。當(dāng)LS5218在含有乙醇酸鹽和十二烷酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，合成出含有2-HA和中長(zhǎng)鏈3-HA組成的共聚物，平均分子量可以達(dá)到34000 Dr。

最近Park等人新構(gòu)建的重組大腸桿菌導(dǎo)入了基因PhaC1Ps6-19和PctCp，其可以利用結(jié)構(gòu)不相關(guān)的碳源合成含有2HB單體的PHA。隨著培養(yǎng)基中2HB和3HB的濃度變化，合成的PHA中2HB的單體的摩爾百分?jǐn)?shù)在10mol%到60mol%之間變化。當(dāng)加入的2HB濃度為2 g/L，3HB濃度為0.5 g/L時(shí)，合成的PHA中2HB單體的摩爾百分比達(dá)到最高61mol%,占PHA重量的26.7%。

另一個(gè)重組的大腸桿菌XLdh導(dǎo)入了PhaC1Ps6-19、PctCp、CimA、LeuBCD和PanE基因，使它可以利用培養(yǎng)基中的3HB，合成含有單體2HB、3HB和少量乳酸單體的PHA。如果在此大腸桿菌中導(dǎo)入R.eutropha的β-酮硫酶和乙酰乙?；?CoA還原酶，就可以利用葡萄糖作為單一的碳源合成P(2HB-3HB-LA)，此時(shí)共聚物中2HB的摩爾百分比減少到了3mol%，可能是因?yàn)橐阴?CoA在合成2HB-CoA、3HB-CoA和lactyl-CoA3個(gè)單體中，主要用于合成PHA中的3HB-CoA，生成的聚(47 mol% 2HB-50 mol% 3HB-3mol% LA)的平均分子量、聚合度和玻璃化溫度分別是20000、1.69和9.7 ℃[35]。

4 展望

盡管目前還不知道PHA合成酶的精確結(jié)構(gòu)，但突變體分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)影響PHA合成酶活性和底物特異性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，通過(guò)PHA合成酶的分子改造可以進(jìn)一步提高生物PHA合成酶活性的效率及增加合成PHA的種類(lèi)。利用基因工程技術(shù)可以構(gòu)建合成多種單體及不同比例的代謝途徑，進(jìn)而合成滿足不同實(shí)際需求的PHA，促進(jìn)PHA的商業(yè)化進(jìn)程。目前對(duì)PHA合成的研究，也很重視如何從低廉的碳源中更高效經(jīng)濟(jì)的獲得PHA。目前很多研究結(jié)果展示，許多自然界中的微生物可以從淀粉，廢棄的脂肪酸甚至工業(yè)中的廢水中合成PHA。這樣既能變廢為寶又能對(duì)環(huán)境產(chǎn)生積極的影響。此外，在細(xì)菌中有很多的調(diào)控系統(tǒng)對(duì)PHA的合成具有明顯的影響，如群體感應(yīng)系統(tǒng)、雙因子調(diào)控系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等。如果能清楚地了解這些機(jī)制，就能使我們做出更好的應(yīng)對(duì)機(jī)制，提高PHA的合成效率。

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