汪 茗， 章 堯， 謝向榮， 劉善浩， 戚之琳， 畢富勇

(1.皖南醫(yī)學(xué)院生化教研室， 蕪湖 241002; 2.弋磯山醫(yī)院心內(nèi)科，蕪湖 241001; 3.弋磯山醫(yī)院血液內(nèi)科， 蕪湖 241002)

DNA甲基化異常作為一種表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，是細(xì)胞癌變過程中的早期、頻發(fā)事件，并且是一個(gè)可逆的生物學(xué)過程。因此甲基化的特異基因可作為腫瘤早期診斷、治療的分子標(biāo)志，而對特異基因進(jìn)行去甲基化處理則可以達(dá)到治療腫瘤的目的[1-2]。RASSF10是最近鑒定出的RASSF家族的新成員[3]。已有報(bào)道提示RASSF10的啟動子甲基化在甲狀腺癌、前列腺癌[3-4]等腫瘤中頻繁出現(xiàn)。本研究以人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Molt-4細(xì)胞為研究對象，采用MTT、RT-PCR、Western blot、COBRA等方法研究甲基化抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′deoxycytidine，5-Aza-dC)對Molt-4細(xì)胞的增殖、RASSF10 mRNA、蛋白表達(dá)及RASSF10基因啟動子甲基化狀態(tài)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Molt-4細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物研究所。

1.1.2 試劑 5-Aza-dC購自Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；RNA提取、RT-PCR試劑盒購自TAKARA公司；基因組DNA提取試劑盒購自Qiagen公司；DNA甲基化試劑盒購自Millipore公司；DNA marker 及引物均購自上海生工公司；RASSF10多克隆抗體購自Abgent公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，將Molt-4細(xì)胞置于37℃，5% CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。

1.2.2 MTT(四唑鹽比色法) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×105/mL，接種于96孔板。5-Aza-dC作用24、48、72 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL, 37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心棄上清，加DMSO 150 μL,震蕩后酶標(biāo)儀570 nm下測定各孔的吸光度A，按下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(A對照-A實(shí)驗(yàn))/A對照×100%

1.2.3 RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 5-Aza-dC作用72 h后，Trizol提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA純度(A260/A280>1.8)。兩步法RT-PCR按試劑盒說明進(jìn)行擴(kuò)增。RASSF10上游引物:5′-GCGCCATGGATCCTTCGGAAAA-3′，下游引物: 5′-GGCAGCGCCTCGTCGTC GTCCT-3′，產(chǎn)物244 bp。GAPDH為內(nèi)參，上游引物:5′-TGAAGGTCGGAGTCA ACGGATT TGGT-3′，下游引物：5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′，產(chǎn)物984 bp[4]。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃維持。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，捷達(dá)801凝膠成像分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析。用ARASSF10/AGAPDH表示RASSF10 mRNA相對水平。

1.2.4 Western blot(免疫印跡法) 收集5-Aza-dC處理72 h后Molt-4細(xì)胞的總蛋白，按100 μg/孔上樣。10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至NC膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h，封Ⅰ抗RASSF10 (1∶500)4℃過夜。次日TBST、TBS洗膜。封HRP標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶2000)45 min，同法洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光，將膜置于暗盒中，暗室內(nèi)膠片曝光，沖洗膠片。

1.2.5 COBRA(亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法) 取對照組及10 μmol/L 5-Aza-dC處理72 h后的Molt-4細(xì)胞，按DNA提取說明書提取各組細(xì)胞基因組DNA，并進(jìn)行 DNA純度測定：A260/A280>1.8。按DNA甲基化試劑盒說明書對DNA進(jìn)行修飾及純化，并取亞硫酸氫鈉修飾的DNA 進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增方法參考文獻(xiàn)[4]。其外部引物RASSF10 COU1:5′-ATAAGTAGAGGAGTTAGTAGGTTAAAGGAGA-3′，RASSF10 COL1: 5′-CCCCCAAAACC CAAAACTATAACTAA A-3′；半巢式PCR內(nèi)部引物為 RASSF10 COL2: 5′-A AATACAAA AAACTCAA AACCCAA ACCC-3′和 RASSF10 COU1[4]。取PCR 產(chǎn)物(241bp)用10 U TaqI進(jìn)行消化，將產(chǎn)物進(jìn)行2% 瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果判斷：樣本出現(xiàn)消化的短鏈DNA條帶者說明該基因啟動子區(qū)存在甲基化，PCR后具有TaqI識別位點(diǎn)，可被TaqI識別并水解；樣本未出現(xiàn)消化短鏈DNA條帶者為基因啟動子區(qū)不存在甲基化，PCR后沒有TaqI識別位點(diǎn)，不能被水解；結(jié)果介于兩者之間的為該基因啟動子存在部分甲基化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用單因素方差分析，組內(nèi)比較用t檢驗(yàn)，P<0.05有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-dC對Molt-4細(xì)胞增殖的影響 如圖1所示，Molt-4細(xì)胞經(jīng)3種不同濃度5-Aza-dC處理后，細(xì)胞增殖抑制率均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.01)，且不同濃度組之間的區(qū)別亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，5-Aza-dC對Molt-4細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴性。

2.2 5-Aza-dC對RASSF10 mRNA表達(dá)的影響 如圖2所示，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，RASSF10 mRNA在對照組Molt-4細(xì)胞中不表達(dá)，而經(jīng)過2.5、5、10 μ mol/L的5-Aza-dC處理后可見RASSF10 mRNA恢復(fù)表達(dá)，RASSF10表達(dá)強(qiáng)度與5-Aza-dC的濃度呈劑量依賴關(guān)系。RASSF10相對表達(dá)量用ARASSF10/AGAPDH表示，結(jié)果如表1所示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 5-Aza-dC對Molt-4細(xì)胞增殖的影響

圖2 5-Aza-dC對Molt-4細(xì)胞RASSF10 mRNA 表達(dá)的影響

表1 5-Aza-dC對Molt-4細(xì)胞RASSF10 mRNA表達(dá)的影響

*—P<0.05, **—P<0.01vscontrol.

圖3 5-Aza-dC對Molt-4細(xì)胞RASSF10蛋白表達(dá)的影響

表2 5-Aza-dC對Molt-4細(xì)胞RASSF10蛋白表達(dá)的影響

*—P<0.05, **—P<0.01vscontrol.

2.3 5-Aza-dC對RASSF10蛋白表達(dá)的影響 由圖3，表2可見，對照組及5-Aza-dC各濃度組細(xì)胞的內(nèi)參GAPDH表達(dá)量無顯著區(qū)別，而對照組細(xì)胞無RASSF10表達(dá)，5-Aza-dC各處理組的RASSF10蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，與5-Aza-dC濃度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

2.4 5-Aza-dC對RASSF10基因啟動子甲基化狀態(tài)的影響 COBRA實(shí)驗(yàn)檢測Molt-4細(xì)胞采用5-Aza-dC處理前后RASSF10基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)，結(jié)果如圖4所示。對照組消化的DNA條帶明顯，說明對照組存在啟動子甲基化現(xiàn)象，PCR擴(kuò)增后含有TaqI識別位點(diǎn)，可被TaqI消化水解，出現(xiàn)水解條帶。而經(jīng)10 μmol/L 5-Aza-dC作用72 h后的處理組，可見清晰的未被TaqI消化水解的條帶，消化水解的DNA條帶不明顯。說明啟動子有甲基化和非甲基化共存的現(xiàn)象，原先甲基化的RASSF10基因啟動子區(qū)域大部分被去甲基化了。

圖4 5-Aza-dC對Molt-4細(xì)胞RASSF10基因啟動子甲基化的影響

3 討論

腫瘤基因啟動子區(qū)域DNA甲基化是遺傳外修飾調(diào)控的一種重要方式，它可引起基因表達(dá)沉默，從而下調(diào)抑癌基因表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。近年來，越來越多的研究顯示人類眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與DNA甲基化的異常有關(guān)，基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化可導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，這也是白血病發(fā)病的重要機(jī)制之一[2,5-6]。

Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族(Ras-association domain family,RASSF)則是Ras激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一組負(fù)向調(diào)節(jié)基因，通過調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡而介導(dǎo)腫瘤抑制效應(yīng)。RASSF至少包括10個(gè)成員：RASSF1-10。其中RASSF1-6屬于“經(jīng)典成員”，都含有C末端的RA(Ras-association)結(jié)構(gòu)域和SARAH(Sav/RASSF/Hippo)結(jié)構(gòu)域。而RASSF7-10的N末端都含有RA結(jié)構(gòu)域但是缺乏SARAH結(jié)構(gòu)域，因此被稱為“N端RASSF家族”[7-8]。它們參與了很多關(guān)鍵的生物學(xué)過程，比如：細(xì)胞死亡、增殖、微觀的穩(wěn)定性、啟動子的甲基化、對缺氧的反應(yīng)等。RASSF10是“N端RASSF家族”的新成員，是新近被鑒定出的含一個(gè)單獨(dú)的外顯子基因，位于11 p15.2，含有一個(gè)大的CpG島，覆蓋了這個(gè)基因的大部分[7-10]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道在人類眾多腫瘤中發(fā)現(xiàn)RASSF的一些成員頻繁失表達(dá)，且認(rèn)為RASSF基因啟動子的甲基化是其失表達(dá)的重要原因[7-13]。但有關(guān)RASSF10甲基化與白血病相關(guān)性的研究還比較少，關(guān)于急性白血病RASSF10啟動子甲基化的研究尚處于初級階段，本研究探討了甲基化抑制劑5-Aza-dC在體外對白血病細(xì)胞株Molt-4細(xì)胞的增殖抑制作用及對RASSF10基因啟動子甲基化的影響。

5-Aza-dC是常用的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的甲基轉(zhuǎn)移活性而發(fā)揮去甲基化作用。已有研究報(bào)道5-Aza-dC可使多種含有CpG島的高甲基化抑癌基因重新表達(dá)，從而使抑癌基因恢復(fù)其抑癌的功能。以往研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)基因啟動子區(qū)域甲基化而失活的抑癌基因被5-Aza-dC處理后可被重新激活，如RASSF1A基因[14]、p16基因[15]等。本研究采用5-Aza-dC處理急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Molt-4細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同濃度5-Aza-dC處理后，Molt-4細(xì)胞增殖均受到了明顯抑制，5-Aza-dC具有顯著抑制白血病細(xì)胞增殖的作用。為進(jìn)一步探討5-Aza-dC抑制白血病細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，本研究還繼續(xù)觀察了其對抑癌基因RASSF10基因啟動子甲基化狀態(tài)產(chǎn)生的影響。為減少因5-Aza-dC自身對細(xì)胞的毒性作用而對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，本研究選用的是3種較小的有效濃度來處理Molt-4細(xì)胞，結(jié)果顯示在對照組Molt-4細(xì)胞中RASSF10基因啟動子是被甲基化修飾的，RASSF10 mRNA、蛋白在Molt-4細(xì)胞中不表達(dá)，但經(jīng)過10 μ mol/L 5-Aza-dC處理后，RASSF10基因啟動子部分發(fā)生去甲基化作用，其RASSF10 mRNA、蛋白重新出現(xiàn)表達(dá)，證明了RASSF10基因啟動子的高度甲基化修飾是導(dǎo)致抑癌基因RASSF10失表達(dá)的主要機(jī)制。5-Aza-dC可通過使抑癌基因RASS F10基因發(fā)生去甲基化作用，進(jìn)而使RASSF10重新恢復(fù)表達(dá)而發(fā)揮抗白血病效應(yīng)。

綜上，本研究結(jié)果提示甲基化抑制劑5-Aza-dC能使急性淋巴細(xì)胞白血病Molt-4細(xì)胞RASSF10基因的甲基化程度降低，誘導(dǎo)其重新表達(dá)，從而抑制了Molt-4細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果既為RASSF10作為白血病治療新靶點(diǎn)的確認(rèn)提供了理論依據(jù)，也為急性白血病的去甲基化治療提供了理論基礎(chǔ)。

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