朱雄偉， 蘇騰甲， 張佑紅， 徐智鵬， 張 凱， 劉玉蘭

(1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過(guò)程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430074；2.中船重工第七一二研究所， 武漢 430074； 3.武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院, 武漢 430074)

隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的快速發(fā)展，與腫瘤基因治療相關(guān)的研究工作正在不斷深入。近年來(lái)，非病毒基因傳遞體系成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)[1]。與病毒載體相比，非病毒載體具有低免疫反應(yīng)，無(wú)基因片段大小限制，使用簡(jiǎn)單，制備方便，便于保存等優(yōu)點(diǎn)[2]。自Boussif等[3]報(bào)道了聚乙烯亞胺(PEI)可作為非病毒載體之后，PEI成為了非病毒基因載體中研究最多的效果最好的經(jīng)典載體材料。然而目前PEI在腫瘤基因治療上的效果并不令人滿意，其中很重要的原因在于高分子量的PEI毒性大且缺乏腫瘤靶向性。為了解決這個(gè)問(wèn)題，各種可降解的鍵被用來(lái)合成交聯(lián)低分子量PEI，如酯鍵和二硫鍵等，以此得到可降解的交聯(lián)PEI載體，使它具有高效低毒性的特性[4]。此外，給PEI偶聯(lián)上配體，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入靶細(xì)胞，可以顯著增加載體的轉(zhuǎn)染效率和靶向性。偶聯(lián)的配體有很多種，如半乳糖、甘露糖、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、RGD肽、葉酸以及各種單抗等[5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員報(bào)道了許多與轉(zhuǎn)鐵蛋白介導(dǎo)基因腫瘤靶向傳遞相關(guān)的研究工作，結(jié)果均表明轉(zhuǎn)鐵蛋白具有很強(qiáng)的腫瘤特異性，能顯著提高載體在腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。

由于惡性腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，所以本研究將交聯(lián)低分子量PEI與人轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)，制備了一種新型腫瘤靶向人轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)交聯(lián)聚乙烯亞胺基因載體。通過(guò)載體上的轉(zhuǎn)鐵蛋白配體與腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合，可特異性將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，從而增強(qiáng)該載體對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和靶向性，增強(qiáng)惡性腫瘤基因治療的療效。對(duì)該載體的各項(xiàng)性能、細(xì)胞毒性和體外轉(zhuǎn)染效率都進(jìn)行了全面、細(xì)致地研究和評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

聚乙烯亞胺(分子量18kDa)購(gòu)自美國(guó)Alfa Aesar公司。聚乙烯亞胺(分子量25kDa)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。人轉(zhuǎn)鐵蛋白和環(huán)硫乙烷購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。甲醇和二甲亞砜購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛牛血清、胰蛋白酶、雙抗(青霉素-鏈霉素)、PBS緩沖液、噻唑蘭均為Invitrogen公司產(chǎn)品。還原型谷胱甘肽購(gòu)于上海三杰生物技術(shù)有限公司。熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司。所有試劑均為分析級(jí)，購(gòu)回后直接使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA的提取和純化

本實(shí)驗(yàn)使用了螢光素酶(pGL-3)和增強(qiáng)型熒光蛋白(pEGFP)兩種報(bào)告基因質(zhì)粒。pGL-3在JM109大腸桿菌中轉(zhuǎn)化，pEGFP在DH5α大腸桿菌中轉(zhuǎn)化。兩種菌均用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃下，250r/min的搖床中擴(kuò)增12 h。采用Omega公司的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒，從菌液中提取和純化質(zhì)粒DNA，用超純水洗脫，無(wú)菌過(guò)濾，所得質(zhì)粒DNA的水溶液凍存于-80℃。

1.2.2 交聯(lián)PEI的合成

在25 mL圓底燒瓶中，將500 mg 1800 Da PEI溶于3 mL去離子水中，用0.1 M HCl溶液將溶液pH值調(diào)至7。減壓旋干，得到黃色固體。將該固體溶于3 mL CH3OH中，并轉(zhuǎn)移至聚合管中，通入氬氣，加入一定量的環(huán)硫乙烷后封管，磁力攪拌，在50℃油浴下反應(yīng)24 h。反應(yīng)完畢后，產(chǎn)物減壓旋干，得到巰基化的PEI。將1 g 巰基化的PEI溶于2 mL CH3OH中，然后加入1 mL DMSO，50℃油浴反應(yīng)48 h。反應(yīng)完畢后所得的溶液在乙醚中沉淀3次，真空干燥后得到交聯(lián)PEI。

1.2.3 TCP的合成

取100 mg飽和Tf溶解在1 mL pH值5.5的NaAc緩沖液中，加入0.5 mL 50 mmol/L 高碘酸鈉，反應(yīng)0.5 h。粗產(chǎn)物用葡聚糖G 25柱層析脫鹽。以0.1 mol/L NaAc緩沖液(pH值5.5)為洗脫劑。在270 nm處監(jiān)測(cè)餾分，收集氧化后的Tf，用超速離心管濃縮，稀釋至0.1 mmol/L，然后取一定量加到交聯(lián)PEI的NaCl溶液中(300 mg/5 mL)，室溫?cái)嚢?0 min后，分少量多次加入2 mg 氰基硼氫化鈉，繼續(xù)攪拌24 h，用3 M NaCl溶液將混合液的鹽濃度調(diào)節(jié)至0.5 M。反應(yīng)物過(guò)陽(yáng)離子交換柱，在20 mM HEPES(pH值7.3)的條件下，以0.5～3M 的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，合并在1.7～3M鹽濃度下收集的洗脫液，透析凍干，得到最終產(chǎn)物TCP，凍存于-80℃ 。

1.2.4 復(fù)合物粒徑和電位測(cè)定

TCP/DNA復(fù)合物的粒徑和電位使用粒度及zeta電位分析儀( zetasizer Nano ZS90，Malvern，英國(guó))測(cè)定。將TCP 和質(zhì)粒DNA(pGL-3)分別溶于去離子水中，配成濃度分別為1 mg/mL和200 ng/μL的水溶液，不同(質(zhì)量比)w/w比的TCP/DNA復(fù)合物。 混勻后，在室溫放置30 min，然后將復(fù)合物溶液用150 mM NaCl溶液稀釋到1 mL來(lái)測(cè)定復(fù)合物的粒徑。用超純水稀釋到1 mL來(lái)測(cè)定復(fù)合物的zeta電勢(shì)。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳

將W/W比為5、10、15、20、25 和30 的TCP/DNA復(fù)合物樣品和其對(duì)應(yīng)的與60 mM還原型谷胱甘肽混合后的樣品，分別加入含有GelRed染料的0.7%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)(80 V，80 min)，然后在凝膠成像儀下經(jīng)紫外照射成像。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株(HepG2)、人子宮頸癌細(xì)胞株(Hela)和人胚胎腎細(xì)胞株(293T)用含10%胎牛血清 (FBS)、2 mg/mL NaHCO3和100 U/mL雙抗 (1%的青霉素-鏈霉素10000 U/mL) 的DMEM (Gibco) 培養(yǎng)基在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.7 體外細(xì)胞毒性

用MTT法測(cè)定聚合物的細(xì)胞毒性。將Hela細(xì)胞以5000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后將TCP水溶液按濃度梯度加至孔中。37 ℃培養(yǎng)24 h，吸棄舊液，用新鮮DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h，吸棄舊液，加入DMSO 150 μL。以正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，用Bio-Rad酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸收度值，計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.2.8 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

將HeLa細(xì)胞或A549細(xì)胞以細(xì)胞數(shù)為6×105/孔接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后分別加入w/w為5、10、15和20的TCP/DNA復(fù)合物，每孔加入含1 μg質(zhì)粒的復(fù)合物，孵育一定時(shí)間后，吸棄舊液，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h保證蛋白質(zhì)的充分表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，同時(shí)進(jìn)行了25 kDa PEI與DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，作為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合物的粒徑和電位

按照1.2.4粒徑和電位測(cè)試方法結(jié)果如圖1。

圖1 TCP/DNA復(fù)合物在w/w為5～30范圍內(nèi)的粒徑和zeta電位

當(dāng)W/W比在5～30之間時(shí)，TCP/DNA復(fù)合物的平均粒徑約為155 nm。粒徑隨著w/w比的增大而緩慢增加，這可能是由于材料濃度的增大而導(dǎo)致復(fù)合物顆粒之間發(fā)生了聚集。TCP/DNA復(fù)合物的平均表面電位約為+21.6 mV，因此它能將帶負(fù)電的DNA緊密包裹，阻止核酸酶對(duì)DNA的降解，它也能很好的與帶負(fù)電的細(xì)胞膜結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)復(fù)合物的內(nèi)吞。

圖2 TCP/DNA復(fù)合物(w/w= 0～7)的凝膠電泳

A—無(wú)谷胱甘肽；B—有谷胱甘肽。

2.2 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

按照1.2.5實(shí)驗(yàn)方法得到在TCP/DNA復(fù)合物在0～7的范圍內(nèi)有無(wú)谷胱甘肽實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。

聚陽(yáng)離子與DNA的結(jié)合能力是基因能夠成功傳遞至細(xì)胞內(nèi)部的重要因素之一，當(dāng)TCP在W/W大于2時(shí)，各孔中的DNA條帶清晰明亮，說(shuō)明TCP能與質(zhì)粒DNA完全復(fù)合，且這些w/w可被用在之后的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中(見(jiàn)圖2A)。用還原型谷胱甘肽模擬細(xì)胞中谷胱甘肽對(duì)二硫鍵的降解，結(jié)果表明各孔DNA都有明顯出孔或拖尾現(xiàn)象(見(jiàn)圖2B)。原因可解釋為：二硫鍵能夠在谷胱甘肽存在下斷裂，而細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽濃度是細(xì)胞外的50倍以上，因此在細(xì)胞外TCP能與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，而進(jìn)入細(xì)胞后，二硫鍵被氧化斷裂，釋放出DNA。

2.3 體外細(xì)胞毒性

基因載體的細(xì)胞毒性對(duì)于該載體以后的臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)非常關(guān)鍵，毒性大必然限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用，所以按照1.2.7體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法得到結(jié)果如圖3。

圖3 TCP的細(xì)胞毒性

TCP在Hela細(xì)胞中的MTT毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與25 Kda PEI相比，TCP的毒性很低，各個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率均超過(guò)75%，這是因?yàn)門CP的主要組成部分是可降解的、生物相容性好的低分子量PEI，從而使材料的毒性大幅降低。此外，隨著TCP濃度的增大，細(xì)胞毒性略有增加。

圖4 TCP/pGL-3復(fù)合物在Hela、HepG2和293T細(xì)胞中的體外轉(zhuǎn)染效率

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

按照1.2.8中的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)方法，不同的TCP/DNA復(fù)合物W/W對(duì)3種細(xì)胞系的影響，及PEI陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果如圖4。

對(duì)3種細(xì)胞系的體外轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，TCP/DNA復(fù)合物在Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率明顯高于PEI(25 kDa)/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。但是，在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率的變化沒(méi)有其他兩個(gè)細(xì)胞系顯著。比如，熒光素酶轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)W/W為15時(shí)，TCP/pGL-3復(fù)合物在Hela細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率與25 kDa PEI對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染效率相比，前者比后者提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。根據(jù)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)染結(jié)果可以證實(shí)，TCP載體能大幅增強(qiáng)外源基因在腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，且轉(zhuǎn)染具有顯著的腫瘤靶向性。

3 結(jié)論

本研究中合成的人轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)交聯(lián)聚乙烯亞胺基因載體(TCP)是一種具有腫瘤靶向能力的、低毒高效的非病毒聚陽(yáng)離子載體。其二硫鍵能在細(xì)胞質(zhì)中降解因而能夠大幅降低材料的毒性。通過(guò)偶聯(lián)的轉(zhuǎn)鐵蛋白配體與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體間的相互作用，可增強(qiáng)該載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和靶向能力。

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