慕東艷，呂國忠 ，孫曉東，王 娜，趙志慧

(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116029;2.大連民族學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，大連 116600)

植物根際土壤中通常生長著大量各種類型的微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌等［1］。其中許多微生物能通過固氮作用，促進(jìn)磷等礦物質(zhì)營養(yǎng)的吸收以及抑制土傳病原物等方式促進(jìn)植物的生長和發(fā)育，保護(hù)植物健康生長［2］。但是，某些微生物卻以植物根系作為侵染點侵染植物，從而對植物的生長造成危害，包括某些致病真菌、卵菌、細(xì)菌和線蟲等。這些土傳致病菌在時間和空間上的傳播對于植物的生長造成了極大的危害。另外，植物根際土壤中各種有益微生物通過競爭、拮抗與重寄生等作用有效地抑制了土傳病害的發(fā)生與傳播。植物根際有益微生物和有害微生物之間的生態(tài)關(guān)系對于植物健康生長與發(fā)育發(fā)揮著巨大的不可替代的作用［3-5］。

黑龍江省是我國中藥材主要產(chǎn)區(qū)之一，其中藥材的產(chǎn)銷總量占到全國的15%左右，其所產(chǎn)北藥也因其質(zhì)量好而暢銷國內(nèi)外。特別是五味子、平貝母和柴胡的人工栽培地區(qū)廣泛，栽培面積大，產(chǎn)量高。近年來，隨著藥用植物種植面積的增加以及連作或復(fù)種面積的不斷擴(kuò)大，隨之而產(chǎn)生的土傳病害也越來越嚴(yán)重，已經(jīng)成為生產(chǎn)中的難點問題［6］。大多數(shù)名貴中藥材的藥用部位是根及根莖等地下部分，而土傳病原菌則侵染和危害中藥材的根部，引起根部病害，嚴(yán)重影響中藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量，并造成重要經(jīng)濟(jì)損失［7-8］。

隨著藥用植物病害危害的不斷加重，藥農(nóng)使用化學(xué)農(nóng)藥的種類和劑量不斷增加，不僅污染了環(huán)境，而且造成中藥材農(nóng)藥殘留量嚴(yán)重超標(biāo)，嚴(yán)重影響藥材質(zhì)量，不利于藥材的加工甚至出口。利用拮抗真菌防治藥用植物土傳病害不僅是生產(chǎn)無公害和優(yōu)質(zhì)中藥材的保證，同時也能夠保持生態(tài)平衡，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展［9］。由于不同的藥用植物或同一藥用植物的不同生長期其根系分泌物不同，其根際微生物種類、數(shù)量和優(yōu)勢菌種均不同。研究藥用植物根際土壤真菌多樣性，從中可以篩選到更多拮抗真菌或有益真菌，為研制生防菌劑和開展藥用植物根際土傳病害的生物防治提供生防菌種資源保障。另外，在藥用植物根際土壤中蘊藏著大量具有生物轉(zhuǎn)化能力的真菌種類，可用于中藥活性成分的生物轉(zhuǎn)化［10］。因此，研究不同的藥用植物根際土壤真菌的多樣性具有重要的理論研究和實際應(yīng)用價值。

本研究采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法對分離自黑龍江省多種藥用植物根際土壤的真菌進(jìn)行鑒定，并對其種群組成和生態(tài)分布進(jìn)行統(tǒng)計與分析。本文研究的首要目的是要明確黑龍江省藥用植物根際土壤真菌的種類資源及區(qū)系分布特點，同時為篩選針對藥用植物土傳病害的拮抗生防菌株和具有生物轉(zhuǎn)化功能的菌株提供豐富真菌資源。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

在2010年7月份和10月份，對黑龍江省伊春、鐵力、綏化、哈爾濱、牡丹江、佳木斯等6個地區(qū)栽培的藥用植物的根際土壤進(jìn)行取樣，共采集土壤樣品220份(表1)，采集的藥用植物種類有五味子、平貝母、刺五加、防風(fēng)、黨參、柴胡、黃芩、桔梗、穿山龍、牛蒡、知母、射干、益母草和紅花，共14種。采樣方法為三點或五點混合采樣法。土壤樣品為采自粘附在不同藥用植物根系上和受根系分泌物影響的土壤顆粒，即根際土壤。在某一地區(qū)某種藥用植物種植區(qū)內(nèi)選取3個或5個(根據(jù)種植面積來選取)采集點，采樣前除去藥用植物主根系周圍土壤表層的枯枝落葉等雜物后，將表層2—3 cm的土層(即未粘附在主根系上的土壤)鏟去，然后選取距植物主根系表面0—1 cm范圍內(nèi)，沿主根系2—15 cm深處土層范圍內(nèi)的土壤樣品(即受植物根系分泌物影響的土壤)進(jìn)行采集，多點采集的土壤樣品經(jīng)充分混合后取約100 g土壤裝入無菌的塑料袋中，并記錄采樣時間、地點和采集樣品種類，帶回實驗室后立即進(jìn)行真菌的分離。

表1 黑龍江省藥用植物根際土壤樣品的采集地點Table 1 The rhizosphere soil sampling regions of medicinal plants grown in Heilongjiang Province

1.2 土壤真菌的分離

采用稀釋平板法和土壤顆粒平板法進(jìn)行土壤真菌的分離，分離培養(yǎng)基為孟加拉紅培養(yǎng)基。(1)稀釋平板法:稱取10 g土壤樣品放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，將三角瓶置于搖床上振蕩25—30min，使土壤顆粒均勻分散于無菌水中，得到稀釋倍數(shù)為10的土壤懸浮液，從中吸取1 mL移入裝有9 mL無菌水的試管中，充分振蕩混勻，為稀釋倍數(shù)102的懸浮液，再吸取10-2稀釋液1 mL，移入裝有9 mL無菌水的試管中，混勻后即成稀釋倍數(shù)為103的懸浮液;依此類推，制成10-4的土壤稀釋液。吸取10-2、10-3、10-4稀釋液1mL置于培養(yǎng)皿中，每個稀釋度重復(fù)2次，與已熔化并冷卻至40℃左右的孟加拉紅培養(yǎng)基混合均勻，然后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)土壤顆粒平板法:用滅菌的小扁勺取土樣0.005 g左右，分散、弄碎后，將其均勻散布在凝固了的孟加拉紅培養(yǎng)基上，每個土樣重復(fù)2次，然后將培養(yǎng)皿置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。5—7 d后，對分離到的真菌菌落進(jìn)行計數(shù)和分析，將單個菌落挑出純化并保存菌種。

1.3 土壤真菌的純化與鑒定

通過尖端菌絲挑取法，將在孟加拉紅平板培養(yǎng)基上生長出的不同形態(tài)和顏色的真菌菌落轉(zhuǎn)接入PDA培養(yǎng)基或其它標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(SNA、SMA、CYA、CA、MEA、PCA培養(yǎng)基等)上進(jìn)行純化培養(yǎng)，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5—15 d后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行顯微形態(tài)觀察，參照相關(guān)真菌分類文獻(xiàn)［11-16］進(jìn)行真菌形態(tài)鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

分離頻率用于比較和判斷真菌的優(yōu)勢種群，分離頻率的計算公式:

分離頻率(%)=某一分離物的總數(shù)(株)/所有分離物總數(shù)(株)×100%

真菌種群的多樣性水平通過Shannon多樣性指數(shù)(H')、Pielou均勻度指數(shù)(J)和Margalef豐富度指數(shù)(R)進(jìn)行分析:

式中，Pi是第i種的個體數(shù)占總個體數(shù)的比例，可以用Ρi=Ni/N求出，Ni為第i種物種個體數(shù)，N為總個體數(shù)，S為每個樣品中的物種總數(shù)。

Jaccard相似性指數(shù)

式中，a，b分別為兩種生境類型中真菌的種數(shù)或?qū)贁?shù)，c為兩種生境類型中共有的真菌種數(shù)或?qū)贁?shù)，用于比較兩個生境中真菌種類組成的相似程度。根據(jù)Jaccard相似性系數(shù)原理:當(dāng)Cj為0.00—0.25時，為極不相似;當(dāng)Cj為0.25—0.50 時，為中等不相似;當(dāng)Cj為 0.50—0.75 時，為中等相似;當(dāng)Cj為0.75—1.00 時，為極相似。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑龍江省藥用植物根際土壤真菌的種類與數(shù)量組成特點

通過對黑龍江省6個地區(qū)的14種藥用植物根際土壤真菌的分離培養(yǎng)，共分離得到真菌1016株，其中805株真菌經(jīng)形態(tài)鑒定明確到種級分類單位，它們屬于35屬86種(表2)。而其它211株為培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生子實體結(jié)構(gòu)而無法明確其分類地位的真菌，統(tǒng)一歸入無孢類群，根據(jù)菌落及菌絲形態(tài)特征，將它們初步歸為5個類群組。試驗中經(jīng)分離和鑒定出的真菌種類分別是接合菌門的被孢霉屬Mortierella、毛霉屬Mucor、小克銀漢霉屬Cunninghamella、犁頭霉屬Absidia、孢球托霉屬Gongronella、根霉屬Rhizopus、接霉屬Zygorhynchus共7屬10種，占總菌株數(shù)的7.78%;子囊菌門的毛殼屬Chaetomium，即1屬2種，占0.69%;無性型真菌的27屬74種，占70.76%，分別是青霉屬Penicillium14個種，曲霉屬Aspergillus12個種，木霉屬Trichoderma8個種，鐮孢菌屬Fusarium5個種，金孢屬Chrysosporium4個種，輪枝菌屬Verticillium3個種，枝頂孢屬Acremonium、腐質(zhì)霉屬Humicola、枝孢屬Cladosporium、粘帚霉屬Gliocladium、漆斑菌屬Myrothecium、擬青霉屬Paecilomyces、帚霉屬Scopulariopsis各2個種，鏈格孢屬Alternaria、節(jié)菱孢屬Arthrinium、白僵菌屬Beauveria、單孢霉屬Chloridium、外瓶霉屬Exophiala、膝梗孢屬Gonytrichum、白地霉屬Geotrichum、粘束孢屬Graphium、絲葚霉屬Papulaspora、莖點霉屬Phoma、毛癬菌屬Trichophyton、毛束霉屬Trichurus、沃德霉屬Wardomyces、枝穗霉屬Clonostachys各1個種。

在分離獲得的各土壤真菌類群中，無孢類群真菌數(shù)量最多，占菌株總數(shù)的20.77%，是黑龍江省栽培藥用植物根際土壤中最大的未知種類的真菌類群。Penicillium、Aspergillus、Trichoderma及Fusarium是黑龍江省栽培藥用植物根際土壤中可明確真菌種類中數(shù)量最多的類群，分別占到菌株總數(shù)的16.93%、14.76%、8.46%和6.69%，是藥用植物根際土壤中的優(yōu)勢種群。而Gliocladium、Chrysosporium、Mucor、Cladosporium、Acremonium、Rhizopus分別占菌株總數(shù)的5.02%、4.23%、4.13%、3.74%、2.36%和2.26%，是藥用植物根際土壤中的亞優(yōu)勢種群。Paecilomyces和Alternaria是第三大優(yōu)勢種群，分別占1.48%和1.18%(表3)。Clonostachys、Exophiala、Geotrichum、Gonytrichum、Mortierella、Papulaspora、Trichophyton的菌株數(shù)僅為 1，是黑龍江省栽培藥用植物根際土壤中的稀有真菌種群。

如表2所示，不同藥用植物根際土壤真菌的種群組成和結(jié)構(gòu)存在一定的差異，各真菌屬種在不同的藥用植物根際土壤中的優(yōu)勢度不同，不同的藥用植物的根際土壤真菌區(qū)系結(jié)構(gòu)也不同。在14種藥用植物中，從五味子根際土壤中分離獲得的真菌種類最多，達(dá)到33屬真菌。無孢類群是14種藥用植物根際土壤真菌中數(shù)量占優(yōu)的類群，但它們最少屬于5個菌落特征明顯不同的類群。除無孢類群外，五味子根際土壤中的優(yōu)勢類群是青霉屬、曲霉屬和木霉屬，它們占五味子根際土壤真菌總菌株數(shù)的相對分離頻率分別為13.64%、11.36%和8.52%。從平貝母根際土壤中分離出26屬真菌，其優(yōu)勢類群為青霉屬、曲霉屬和鐮孢菌屬，它們占平貝母根際土壤真菌總菌株數(shù)的相對分離頻率分別為14.4%、14.4%和10.4%。從柴胡根際土壤中分離得到20屬真菌，其優(yōu)勢類群為曲霉屬、青霉屬和木霉屬，它們占柴胡根際土壤真菌總菌株數(shù)的相對分離頻率分別為16.22%、12.16%和10.81%。其余11種藥用植物根際土壤中除無孢類群外，青霉屬、曲霉屬、木霉屬和鐮孢菌屬也為優(yōu)勢真菌類群。

表2 黑龍江省藥用植物根際土壤真菌種群組成Table 2 The fungal composition in rhizoshphere soil of medicinal plants in Heilongjiang Province

表3 黑龍江省藥用植物根際土壤真菌優(yōu)勢種群的分離頻率Table 3 The isolating frequencies of the major fungal genera in the rhizosphere soil of medicinal plants in Heilongjiang Province

2.2 黑龍江省3種主要藥用植物根際土壤真菌種群結(jié)構(gòu)組成與多樣性分析

五味子、平貝母、柴胡是黑龍江省栽培區(qū)域最廣泛和栽培面積最大的藥用植物，它們在伊春、鐵力、綏化、哈爾濱、牡丹江和佳木斯地區(qū)均有種植，且種植面積較大。以這3種藥用植物為目標(biāo)植物來分析它們的根際土壤真菌多樣性。

2.2.1 不同地區(qū)3種主要藥用植物根際土壤真菌多樣性特點

在黑龍江省6個采樣地點間的藥用植物根際土壤真菌種群的多樣性水平存在差異(表4)。從真菌屬的數(shù)量上看，黑龍江省伊春地區(qū)的最高，共分離到25屬真菌，而綏化的最低，僅分離到14屬真菌。伊春地區(qū)真菌多樣性指數(shù)(H')和豐富度指數(shù)(R)均最高，分別為2.9574和5.6683，而佳木斯地區(qū)真菌均勻度指數(shù)(J)最高，為 0.9200。

表4 黑龍江省6個采樣地區(qū)3種主要藥用植物根際土壤真菌種群的多樣性指數(shù)Table 4 Diversity indices of fungal communities in rhizosphere soil of three main medicinal plants in six sampling regions of Heilongjiang Province

2.2.2 不同地區(qū)3種主要藥用植物根際土壤真菌組成的相似性

在黑龍江省6個采樣地點間藥用植物根際土壤真菌的種群相似性系數(shù)在0.3704—0.6315之間，最高值為牡丹江與綏化的0.6315，最低值為牡丹江與哈爾濱的0.3704(表5)。根據(jù)Jaccard相似性原理，各地區(qū)之間的真菌相似性系數(shù)處于中等不相似與中等相似之間?？傮w來看，黑龍江省6個采樣地區(qū)的藥用植物根際土壤真菌種群相似性較低。

表5 黑龍江省6個采樣地區(qū)3種主要藥用植物根際土壤真菌相似性系數(shù)(Cj)Table 5 Similarity coefficients of the fungi isolated from rhizosphere soil of three main medicinal plants in six sampling regions of Heilongjiang Province

3 討論

關(guān)于藥用植物內(nèi)生真菌多樣性及微生物群落多樣性的系統(tǒng)研究報道較多［17-19］，而有關(guān)藥用植物根際土壤真菌多樣性的系統(tǒng)研究報道較少。本研究從黑龍江省6個地區(qū)栽培的藥用植物根際土壤樣品中分離和鑒定出真菌35屬86種，對不同的藥用植物以及不同地區(qū)藥用植物根際土壤真菌的種類組成、區(qū)系分布和多樣性特點進(jìn)行了比較分析。研究結(jié)果表明，青霉屬Penicillium、曲霉屬Aspergillus、木霉屬Trichoderma及鐮孢菌屬Fusarium真菌是黑龍江省藥用植物根際土壤真菌的優(yōu)勢類群，這與已有的關(guān)于藥用植物根際土壤真菌多樣性的報道相似［20-21］。不同藥用植物根際土壤中存在豐富的真菌資源，但其真菌種類組成、數(shù)量和分布具有較大的差異性。五味子根際土壤真菌中青霉屬、曲霉屬和木霉屬為優(yōu)勢菌群，與潘爭艷等［22］對遼寧栽培五味子根際土壤真菌的研究結(jié)果相似。不同種類藥用植物根際土壤真菌的種類組成存在很大差異，且相同種類真菌的數(shù)量也存在較大差異。這種差異性可能是由不同藥用植物根系分泌物的不同所造成的［23-24］。

多樣性指數(shù)用來分析真菌種群或群落的多樣性，豐富度指數(shù)用來反映真菌種屬豐富性特點，均勻度指數(shù)是反映真菌種群分布特點的重要指標(biāo)，而相似性系數(shù)是反映兩個不同地區(qū)真菌種群組成相似程度的重要指數(shù)。本文以黑龍江省主產(chǎn)的五味子、平貝母和柴胡為典型代表進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)栽培地區(qū)不同，這3種藥用植物的根際土壤真菌種群多樣性水平的差異較大，相似程度較低。物種多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)與其生境中的土壤環(huán)境、植被以及人為因素(如栽培措施和管理水平)影響密切相關(guān)。伊春、鐵力、綏化和牡丹江雖都地處山區(qū)，林地面積廣，土壤肥沃，富含有機(jī)質(zhì)，但是，伊春的五味子、平貝母和柴胡種植方式以林下種植為主，且歷史悠久;綏化和牡丹江地區(qū)有農(nóng)田種植和林下種植兩種方式，而鐵力地區(qū)卻以農(nóng)田種植為主，林下種植為輔，種植方式的不同導(dǎo)致其根際土壤真菌多樣性水平存在差異，相似性程度較低。在哈爾濱地區(qū)這3種藥用植物種植方式以農(nóng)田種植方式為主，種植區(qū)土壤肥沃，水源充足，氣候適宜，所以，其根際土壤真菌多樣性水平較高。而在佳木斯地區(qū)它們的種植方式雖為農(nóng)田種植，但種植區(qū)位于土壤相對貧瘠地帶，水源也不充足，所以其根際土壤真菌多樣性水平低，但是，其均勻度指數(shù)最高，說明該地區(qū)雖真菌種類資源不豐富，但分布卻很均勻，這可能是由于種植區(qū)域內(nèi)土壤生態(tài)環(huán)境差異不大造成的。雖然五味子、平貝母和柴胡在哈爾濱和佳木斯均為農(nóng)田種植，但是，由于哈爾濱氣候條件、種植區(qū)地理位置較佳木斯佳，其相似性程度較低。綜上所述，藥用植物的種植方式對其根際土壤真菌多樣性水平存在較大影響，同時氣候條件和土壤環(huán)境對其土壤真菌多樣性水平也有一定的影響。本文試驗結(jié)果反映了栽培生境不同對藥用植物根際土壤真菌多樣性存在不同程度的影響，與陳曦等［20］和楊皓［25］等的研究結(jié)論相一致。由于本研究采用傳統(tǒng)的土壤真菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定方法，可能導(dǎo)致不可培養(yǎng)或菌落生長較慢的真菌菌株被忽視。另外，本研究沒有對不產(chǎn)孢類群真菌菌株進(jìn)行確切鑒定(如采用DNA分子序列分析等)，所以，導(dǎo)致本研究獲得的黑龍江省藥用植物根際土壤真菌多樣性指數(shù)相對低些。

木霉菌Trichoderma和粘帚霉菌Gliocladium是非常重要的生防菌，由于它們具有生長迅速和具有拮抗和重寄生的優(yōu)勢特點，它們對土壤中的許多病原菌具有拮抗生防作用［26-27］，已有較多報道利用木霉菌和粘帚霉菌防治植物土傳病害，且取得較好防效［28-29］。本研究從黑龍江省藥用植物根際土壤中分離得到木霉屬8種86株和粘帚霉屬2種51株，有望從中篩選到可用于植物土傳病害防治的有效生防菌株。另外，這些年來關(guān)于利用真菌轉(zhuǎn)化藥用植物活性成分的研究報道很多，而且從中篩選出了具有較高生物活性的真菌菌株［30-32］，這些類群的真菌通常能從藥用植物的根際土壤中分離獲得。不同藥用植物的根系分泌物不同，其根際土壤中可能蘊藏著具有轉(zhuǎn)化藥用植物活性成分的功能真菌資源。本研究分離獲得的大量真菌菌株也為今后開展微生物轉(zhuǎn)化中藥活性成分研究提供了豐富的真菌資源。

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