李 濤，王 鵬

(1.同濟(jì)大學(xué)海洋地質(zhì)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 200092;2.廣州海洋地質(zhì)調(diào)查局，廣州 510760)

自然界中存在的微生物可能多達(dá)上百萬種［1］，然而，它們中的大多數(shù)沒有被觀測到甚至沒有被檢出，這些微生物的存在只能根據(jù)預(yù)測來推斷;不過，這種預(yù)測也僅僅是基于猜測，以目前的技術(shù)還無法完全檢測出微生物多樣性(本文僅討論微生物種數(shù)或豐度)全貌。基于非培養(yǎng)的rRNA技術(shù)是研究環(huán)境微生物多樣性最有效的工具［2］，16S rRNA克隆文庫相比其他研究手段能更多地揭示群落多樣性信息，基于16S rRNA克隆文庫對微生物豐度的預(yù)測更能趨近于客觀真實(shí)，在土壤、水體、潮間帶等環(huán)境中的細(xì)菌豐度的估計得到了廣泛應(yīng)用［3］。

從已發(fā)表的文獻(xiàn)來看，常用于預(yù)測物種豐度的方法主要有兩大類:參數(shù)模型法和非參數(shù)估計法。共有5種參數(shù)模型:逆高斯分布、對數(shù)正態(tài)分布、負(fù)二項式分布、雙參數(shù)(形狀+標(biāo)尺)帕雷托分布、雙指數(shù)分布等，Hong等基于Maple軟件開發(fā)出相應(yīng)的計算程序［3］，供研究使用?；谪S度覆蓋估計法(ACE)以及適用于高異質(zhì)種群的ACE-1法是兩種用得較多的非參數(shù)估計法，基于此算法，Chao等開發(fā)SPADE(Species Prediction And Diversity Estimation)軟件［4］免費(fèi)下載使用。

為防止估計模型的選擇不當(dāng)對估計值可靠性的影響，本文綜合使用了以上參數(shù)模型法和非參數(shù)估計法共7種方法對來自南海陸坡的一沉積物柱中的細(xì)菌豐度進(jìn)行估算，并通過比較各種方法與觀測數(shù)據(jù)的吻合程度，找到最佳估計。此外，由于單一樣品16S rRNA基因文庫規(guī)模較小，不能全面反映細(xì)菌的多樣性，本文從該沉積物柱不同深度采集12個微生物樣品來構(gòu)建細(xì)菌16S rRNA基因文庫。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

2005年5月15日—6月8日IMAGES147航次獲得的深海沉積物柱MD05-2896，采樣點(diǎn)位于南海陸坡區(qū)的南沙珊瑚礁臺地西部邊緣(08°49.50'N，111°26.47'E，水深1 657 m)。采用無擾動箱式采泥器采集沉積物柱，總長11 m，從表層到底層以1 m等間距采樣，共12個微生物樣品，船上于 -20℃ 下保存，運(yùn)回實(shí)驗室后儲存于-80℃。

1.2 PCR擴(kuò)增、RFLP分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

12個微生物樣品各稱取5 g，采用Zhou抽提法［5］分別提取總DNA，使用細(xì)菌16S rRNA通用引物Eubac 27F和Eubac 1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增［6］。PCR擴(kuò)增得到的片斷經(jīng)純化后克隆到pMD-18T(TaKaRa)載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，利用PCR擴(kuò)增引物重新擴(kuò)增插入片斷。使用內(nèi)切酶MspⅠ(Fermentas)切割，分析電泳帶型，挑選不同帶型克隆子測序，并統(tǒng)計不同帶型的克隆子數(shù)，將序列提交到RDPⅡ(ribosomal database project)數(shù)據(jù)庫，利用CHECK-CHIMERA檢驗，去除不合理序列。應(yīng)用BLASTN程序(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索相似性序列，采用ClustalX(Version 1.8)進(jìn)行比對分析，通過PAUP(Version 4.0b10)［7］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用Neighbor-Joining建樹方法，選擇Jukes-Cantor進(jìn)化距離。細(xì)菌16SrRNA基因序列在 Genbank核苷酸數(shù)據(jù)庫中的接受號為 EU048662—EU048694和EU385666—EU385826。

1.3 參數(shù)模型的建立

利用CLUSTUALW軟件對沉積物柱MD05-2896細(xì)菌16S rRNA序列進(jìn)行序列比對分析，計算序列相似性，以99%、98%、97%、95%、90%和80%的序列一致性作為分界標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù) OS clustering程序的算法(http://www.compbio.dundee.ac.uk/Software/OC/oc.html)，利用無加權(quán)組群方法對序列進(jìn)行聚類分析，將群組定義為“分類單元”(OTU)，計算每個分類單元中的出現(xiàn)次數(shù)，即分類單元中的16S rRNA序列數(shù)。將分類單元出現(xiàn)次數(shù)依次從小到大排列，統(tǒng)計出現(xiàn)次數(shù)相同的分類單元個數(shù)。以分類單元出現(xiàn)次數(shù)和對應(yīng)的分類單元個數(shù)的頻次作為進(jìn)一步分析的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參數(shù)模型通過對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，構(gòu)建相應(yīng)的物種豐度分布模型，預(yù)測群落中未觀測到的物種數(shù)據(jù)［8］。首先區(qū)分統(tǒng)計意義上“豐富的”和“稀有的”分類單元。選取一個適當(dāng)?shù)挠医攸c(diǎn)(τ)，當(dāng)分類單元出現(xiàn)次數(shù)＞τ時，則為“豐富的”;當(dāng)分類單元出現(xiàn)次數(shù)＜τ時，則為“稀有的”。然后利用文獻(xiàn)［3］提供的5種參數(shù)模型方法進(jìn)行估計。通過比較不同的估計方法，得出最合理的估計值。選取的標(biāo)準(zhǔn)有:(1)擬合優(yōu)度(GOF)檢驗:自然擬合優(yōu)度(na?ve GOF)和漸進(jìn)擬合優(yōu)度;(2)能得到有生物學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)差;(3)使用物種頻率觀測數(shù)據(jù)的最大限度值(即最大的右截點(diǎn))。

無參數(shù)估計法采用“標(biāo)記釋放回捕法”(MRR)［9］，認(rèn)為被再次觀測到的物種(“回捕”)與僅觀測到一次的物種能達(dá)到均衡，即在多樣性高的群落中，物種被再次觀測到的幾率較小，數(shù)量豐富的物種僅能被觀測到一次;相反在一個多樣性很低的群落，數(shù)量豐富的物種被再次觀測到的幾率則較高。該類方法基于“豐富的”物種和“稀少的”的物種的相對豐度，來建立估算公式，并利用標(biāo)準(zhǔn)差檢驗。本文利用SPADE軟件［4］中提供的2種方法對細(xì)菌豐度進(jìn)行估計。

由于非參數(shù)模型估計一般會低估微生物多樣性;因此，本文主要討論參數(shù)模型對細(xì)菌豐度的估計。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA基因文庫細(xì)菌多樣性

以97%序列相似性作為代表型的分界標(biāo)準(zhǔn)，1 329條細(xì)菌16S rRNA基因序列分別屬于190個系統(tǒng)發(fā)育型，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明這些系統(tǒng)發(fā)育型主要來自17個已知的類群(“門”):浮霉?fàn)罹?Planctomycetes)、變形桿菌(Proteobacteria)、綠屈撓桿菌(ChloroFlexi)、放線菌(Actinobacteria)、螺旋體(Spirochaetes)、疣微菌(Verrucomicrobia)、酸桿菌(Acidobacteria)、擬桿菌(Bacteriodetes)、鐵還原桿菌(Defferribacteres)、硝化螺菌(Nitrospirae)以及 candidate division OP1、OP3、OP8、OP11、JS1、WS3、TM6。細(xì)菌16S rRNA 基因克隆子數(shù)和代表型數(shù)在細(xì)菌“門”中的分布見表1。

2.2 利用模型預(yù)測的結(jié)果

以99%、98%、97%、95%、90%、80%序列相似性作為分類單元的分界，利用無加權(quán)組群方法對1 329條細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行聚類分析，分別組群成212、194、190、168、115、和50個分類單元。利用參數(shù)模型來估算分類單元豐度值，結(jié)果見表2。

從結(jié)果來看(表2)，參數(shù)模型得到的預(yù)測值一般高于非參數(shù)估計法，應(yīng)從參數(shù)模型中尋找最佳估計。Hong等認(rèn)為應(yīng)優(yōu)先考慮與觀測數(shù)據(jù)擬合程度最好的模型，如果存在多個模型與觀測數(shù)據(jù)的擬合程度都較好，則比較他們的標(biāo)準(zhǔn)差［3］，得到最優(yōu)模型，本文也依此尋找最佳估計。從本研究數(shù)據(jù)來看，出現(xiàn)次數(shù)較少(＜5次)，尤其出現(xiàn)次數(shù)為1次的分類單元個數(shù)最多，它們是群落的主體;模型擬合的結(jié)果是否與觀測數(shù)據(jù)吻合，關(guān)鍵是出現(xiàn)次數(shù)小于5次的分類單元個數(shù)的預(yù)測值是否接近觀測值。結(jié)果表明當(dāng)分類單元分界為99%和

90%序列一致性時，雙指數(shù)分布為最佳估計模型，估計值分別為326±40(SE)和127±4(SE);當(dāng)分類單元分界為98%和80%序列一致性時，帕雷托分布為最佳估計模型，估計值分別為251±9(SE)和62±4(SE);當(dāng)分類單元分界為97%和95%序列一致性時，負(fù)二項式分布為最佳估計模型，估計值分別為244±10(SE)和220±6(SE)。圖1顯示了以99%、97%、90%和80%序列一致性為分類單元分界標(biāo)準(zhǔn)，最優(yōu)分布模型估計的分類單元出現(xiàn)次數(shù)及對應(yīng)的分類單元個數(shù)與實(shí)際數(shù)據(jù)的擬合情況。從圖上看，分類單元個數(shù)預(yù)測與實(shí)際值較吻合，尤其是出現(xiàn)次數(shù)較少的分類單元個數(shù)的預(yù)測與實(shí)際數(shù)據(jù)基本一致，選取的模型符合對細(xì)菌豐度的估計。

表1 沉積物柱MD05-2896克隆子在細(xì)菌“門”中的分布Table 1 Bacterial phyla detected among sequenced clones in sediment core MD05-2896

表2 沉積物柱MD05-2896中細(xì)菌的豐度Table 2 Bacterial richness of the core MD05-2896

續(xù)表

圖1 細(xì)菌克隆子庫中的分類單元頻率分布及參數(shù)模型擬合Fig.1 Frequency distribution of OTUs in the bacterial library versus parametric model's fitted values

目前，利用16S rRNA基因序列對細(xì)菌“種”的劃分還存在較大爭議，1%和3%的序列差異都被用于“種”的定義，較合理的辦法是以1%序列差異作為菌株分類標(biāo)準(zhǔn)，以3%作為“種”的分類標(biāo)準(zhǔn)［3］，在此標(biāo)準(zhǔn)下，估計約326±40(SE)個菌株，244±10(SE)個種。

細(xì)菌的“屬”、“科”/“綱”和“門”等分類單元很難通過16S rRNA基因序列的差異來準(zhǔn)確劃分，已有文獻(xiàn)分別將5%、10%和20%的序列差異作為以上各分類單元的界限［10-12］。依此推斷沉積物柱MD05-2896中細(xì)菌群落大約包括62±4(SE)個“門”，127±4(SE)個“科”/“綱”和220±6(SE)個“屬”。

發(fā)射臺架控制系統(tǒng)雙機(jī)冗余熱備份控制技術(shù)研究……………………………………………… 李博，趙慧莉（4-255）

3 討論

3.1 細(xì)菌豐度估計的可靠性

從已發(fā)表的文獻(xiàn)來看，來自不同環(huán)境的樣品，對細(xì)菌豐度的估計值相差很大，如耕地或重金屬污染的土壤中細(xì)菌豐度估計值為300—1 500［8，13］;而未開發(fā)土壤中的細(xì)菌豐度的估計值則高達(dá)6 000—10 000［14］，甚至達(dá)到500 000［15］。16S rRNA基因技術(shù)從環(huán)境樣品中檢出的細(xì)菌一般只有幾十種，最多不過幾百種，不同環(huán)境中細(xì)菌豐度是否有如此大的差別?Hong等認(rèn)為環(huán)境中細(xì)菌豐度不應(yīng)有如此大的差別，這些估計值并不可靠，原因在于研究者選擇了錯誤的模型［3］，但該觀點(diǎn)并未獲得證實(shí)。

為進(jìn)一步探討細(xì)菌豐度估計值的可靠性，本文與Hong等的研究結(jié)果進(jìn)行了比較。本文與Hong等的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)都來自16S rRNA基因文庫，并采用了完全相同的估計模型，但得到細(xì)菌“種”數(shù)的估計值卻相差很大。造成差異的原因可能與樣品本身或構(gòu)建的文庫質(zhì)量等因素有關(guān)。

從估計的結(jié)果來看，本文對細(xì)菌“種”數(shù)的估計值與觀測值相差不大，都為102量級，而且對采自西沙海槽的沉積物柱MD05-2902中的細(xì)菌豐度預(yù)測值為179±9(SE)，也只達(dá)到102量級;然而，Hong等細(xì)菌物種數(shù)量的估計值約為觀測值的10倍左右，為103量級［3］。利用分布模型估計細(xì)菌豐度的原理是利用分類單元出現(xiàn)次數(shù)的頻率分布對觀測值擬合，得出各參數(shù)值，進(jìn)而估計未檢出分類單元個數(shù)。在頻率分布曲線上表現(xiàn)為:曲線左端越陡，利用模型預(yù)測次數(shù)為0(未檢出)的分類單元個數(shù)則越多，預(yù)測值與觀測值差別越大。Hong樣品的細(xì)菌克隆文庫中絕大多數(shù)分類單元出現(xiàn)次數(shù)只有1，即樣品中絕大多數(shù)分類單元被再次觀測到的幾率小，出現(xiàn)次數(shù)為1的分類單元個數(shù)遠(yuǎn)大于出現(xiàn)次數(shù)為2(被再次觀測)的分類單元個數(shù)，頻率分布曲線左端很陡，表明樣品中存在大量未檢測出的分類單元，估計值就遠(yuǎn)大于觀測值。本文研究樣品的細(xì)菌克隆文庫有較多的分類單元出現(xiàn)次數(shù)大于1，頻率分布曲線左端相對較緩(圖1);利用分布曲線預(yù)測未檢出的分類單元個數(shù)較少，即分類單元被再次觀測到的幾率很高，遺漏的分類單元數(shù)量則較少，因而估計值接近觀測值。

3.2 細(xì)菌豐度估計的影響因素

影響細(xì)菌豐度估計值可靠性的因素主要有兩個:首先是估計模型的選擇，不同的估計模型得到的結(jié)果可能有較大的差異;其次是用于估計的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而這種基礎(chǔ)數(shù)據(jù)是通過實(shí)驗手段來獲取的，數(shù)據(jù)質(zhì)量主要取決于對實(shí)驗技術(shù)的評價。

3.2.1 估計方法

目前，對參數(shù)模型和非參數(shù)估計法孰優(yōu)孰劣存在較大的爭議［9］，即便只使用參數(shù)模型，存在如何選擇模型的困惑。

對參數(shù)模型而言，很難建立一個足夠大的微生物多樣性數(shù)據(jù)庫來支持模型的使用和對各模型中的分布參數(shù)進(jìn)行賦值。因為沒有經(jīng)驗值，只能通過理論上來推斷最佳模型。但不同的學(xué)者對最佳模型的選取標(biāo)準(zhǔn)完全不同。Curtis等認(rèn)為細(xì)菌群落具有高動態(tài)性，增長隨意，群落分布符合對數(shù)正態(tài)分布［14］;不過Jeon指出當(dāng)出現(xiàn)次數(shù)為1的分類單元占很高比例時，逆高斯分布模型對微生物豐度有較好的估計［16］;Hong等認(rèn)為并不存在一個普遍適用的模型［3］，只能通過綜合利用各種模型來以增加估計的可靠性。

非參數(shù)估計法完全依賴于分類單元相對豐度的估計，在調(diào)查微生物多樣性的過程中難免出現(xiàn)取樣偏差;此外，非參數(shù)估計法提供的是一個更小范圍的分類單元多樣性，即只從觀察到的分類單元中獲取信息，與參數(shù)模型不同，非參數(shù)估計法不能給出分類單元相對豐度的假想分布，容易忽略了那些“稀少的”分類單元，導(dǎo)致對微生物豐度的低估。

3.2.2 實(shí)驗技術(shù)

就實(shí)驗本身而言，任何實(shí)驗都無法檢測自然界中的全部微生物?；?6S rRNA基因的PCR-RFLP方法也不例外，同樣會造成對生物多樣性的低估，該技術(shù)影響微生物多樣性低估的主要因素是克隆文庫的規(guī)模和實(shí)驗偏差。

圖2 細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫稀疏曲線Fig.2 Rarefaction curves of bacterial 16S rRNA gene library從上到下依次為:8m，7m，4m，6m，2m，11m，3m，surface，1m，9m，10m和5m

(1)克隆文庫的規(guī)模

克隆文庫并非越大越好，因為哪怕構(gòu)建最大的克隆文庫，也不能窮盡所有的微生物。不過，如果克隆文庫選取過小，則會喪失部分物種多樣性信息。文庫要達(dá)到何種規(guī)模，才能滿足完全反映多樣性的要求?稀疏分

析［13］以及克隆文庫的覆蓋度 C值［17］能提供判斷依據(jù)。使用Analytic Rarefaction軟件對本文研究的12個樣品分別繪制16S rRNA基因克隆文庫稀疏曲線(圖2)，從圖上可以看出，所有稀疏曲線在克隆子數(shù)達(dá)到100后趨于平緩，部分達(dá)到平臺期。從表層往下，C值分別為

89%、90%、93%、92%、79%、92%、87%、79%、85%、97%、77%和83%，這些樣品的克隆文庫的C值多數(shù)在90%左右或大于90%以上。綜合稀疏分析和覆蓋度計算結(jié)果，細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫能大致反映微生物多樣性。

(2)實(shí)驗偏差

實(shí)驗過程中的偏差主要表現(xiàn)在總DNA的損耗、PCR擴(kuò)增效率以及PCR偏嗜性。

環(huán)境樣品總DNA的提取，無論是物理裂解，化學(xué)裂解，還是生物裂解，在提取過程中都會引起DNA的損耗。如物理裂解造成長片斷DNA的物理剪切;化學(xué)裂解法不能完全去除腐殖酸、色素和重金屬等雜質(zhì);抽提后殘余的苯酚等會影響PCR的擴(kuò)增效率［18］。

PCR的偏嗜性主要表現(xiàn)在:(1)PCR擴(kuò)增過程中，模板濃度過低會引起模板的隨機(jī)擴(kuò)增［18］，高GC含量的模板比低GC含量的模板擴(kuò)增效率低［19］，低GC含量模板更易于擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物中低GC含量DNA偏多。(2)目前通用的16S rRNA基因引物擴(kuò)增范圍并不能完全覆蓋所有目標(biāo)類群［18］，尤其是針對深海環(huán)境中的微生物，據(jù)Webster等的估計，27F和1492R引物分別覆蓋自然界中全部細(xì)菌的72.9%和16.3%［18］;不過，Webster的觀點(diǎn)可能過于保守，目前還很難找到替代的通用引物，更別說針對深海環(huán)境的通用引物。

雖然基于16S rRNA基因的PCR-RFLP方法會低估環(huán)境中微生物多樣性，但卻是目前最成熟的方法，對微生物豐度的預(yù)測也多基于由該方法所獲取的多樣性數(shù)據(jù)。隨著技術(shù)的發(fā)展，16Sr DNA-DGGE(變性凝膠電泳)、宏基因組文庫中的數(shù)據(jù)也將逐漸用于估計環(huán)境樣品中微生物的豐度，對PCR-RFLP方法進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。

總之，本文對南海陸坡沉積物柱細(xì)菌豐度進(jìn)行最優(yōu)估計估計，以97%序列一致性作為“種”的劃分標(biāo)準(zhǔn)，負(fù)二項式分布模型最優(yōu)，估計細(xì)菌的種數(shù)為244±10(SE)，鑒于16S rRNA基因的PCR-RFLP實(shí)驗技術(shù)會低估細(xì)菌的多樣性，該值可能偏低。

［1］ Tiedje J M.Microbial diversity:of value to whom?ASM News，1994，60:524-525.

［2］ Olsen G J，Lane D J，Giovannoni S J，Pace N R，Stahl D A.Microbial ecology and evolution:a ribosomal RNA approach.Annual Review of Microbiology，1986，40(1):337-365.

［3］ Hong S H，Bunge J，Jeon S O，Epstein S S.Predicting microbial species richness.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103(1):117-122.

［4］ Chao A，Shen T J.Program SPADE(Species Prediction and Diversity Estimation).Program and user's guide Available from:http://chao.stat.nthu.edu.tw.

［5］ Zhou J Z，Davery E，F(xiàn)igure J B，Rivkina E，Gilichinsky D，Tiedje J M.Phylogenetic diversity of a bacterial community determined from Siberian tundra soil DNA.Microbiology，1997，143(12):3913-3919.

［6］ DeLong E F.Archaea in coastal marine environments.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1992，89(12):5685-5689.

［7］ Swofford D L.PAUP:Phylogenetic Analysis Using Parsimony(*and Other Methods).Version 4.0.Sinauer Associates:Sunderland，Massachusetts，1999.

［8］ Hughes J B，Hellmann J J，Ricketts T H，Bohannan B J M.Counting the uncountable:statistical approaches to estimating microbial diversity.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(10):4399-4406.

［9］ Bohannan B J M，Hughes J.New approaches to analyzing microbial biodiversity data.Current Opinion in Microbiology，2003，6(3):282-287.

［10］ Schloss P D，Handelsman J.Status of the microbial census.Microbiology and Molecular biology Reviews，2004，68(4):686-691.

［11］ Hugenholtz P，Goebel B M，Pace N R.Impact of Culture-Independent Studies on the Emerging Phylogenetic View of Bacterial Diversity.Journal of Bacteriology，1998，180(18):4765-4774.

［12］ Sait M，Hugenholtz P，Janssen P H.Cultivation of globally distributed soil bacteria from phylogenetic lineages previously only detected in cultivation-independent surveys.Environmental Microbiology，2002，4(11):654-666.

［13］ Kemp P F，Aller J Y.Bacterial diversity in aquatic and other environments:what 16S rDNA libraries can tell us.FEMS Microbiology Ecology，2004，47(2):161-177.

［14］ Curtis T P，Sloan W T，Scannell J W.Estimating prokaryotic diversity and its limits.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99(16):10494-10499.

［15］ Dykhuizen D E.Santa Rosalia revisited:Why are there so many species of bacteria?Antonie van Leeuwenhoek，1998，73(1):25-33.

［16］ Jeon S O，Bunge J，Stoeck T，Barger K J A，Hong S H，Epstein S S.Synthetic statistical approach reveals a high degree of richness of microbial eukaryotes in an anoxic water column.Applied and Environmental Microbiology，2006，72(10):6578-6583.

［17］ Lee S M，Chao A.Estimating population size via sample coverage for closed capture-recapture models.Biometrics，1994，50(1):88-97.

［18］ Webster G，Newberry C J，F(xiàn)ry J C，Weightman A J.Assessment of bacterial community structure in the deep sub-seafloor biosphere by 16S rDNA-based techniques:a cautionary tale.Journal of Microbiological Methods，2003，55(1):155-164.

［19］ Wintzingerode F V，G?bel U B，Stackebrandt E.Determination of microbial diversity in environmental samples:pitfalls of PCR-based rRNA analysis.FEMS Microbiology Reviews，1997，21(3):213-229.