鄭曉娟 胡新榮 唐澤立 李飛虹 黃 冰 龐天云

宮頸癌的全球發(fā)病率居第二位，在我國，則是婦科惡性腫瘤的第一位死亡原因。宮頸癌起源于正常宮頸上皮，進而發(fā)展為宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)，再經(jīng)過幾年或十幾年可發(fā)展為浸潤癌[1,2]。CIN中10%～20%的病例進展為浸潤癌，其余可長期存在或自行消退[1,2]。尋找與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的分子標(biāo)志，進而尋找CIN進展的分子標(biāo)志是區(qū)分具有不同生物學(xué)特性的宮頸上皮內(nèi)腫瘤和早期提示、診斷宮頸癌的關(guān)鍵。在宮頸腫瘤中常見的染色體擴增區(qū)域的基因位于11q22的cIAP1、5p13的Dab2等。cIAP1是1個凋亡抑制基因，在宮頸腫瘤中的表達增加[3]。Dab2為分裂原反應(yīng)性磷酸化蛋白基因。癌基因cIAP1和抑癌基因Dab2均是新近被注意的，相關(guān)報道還很少，在宮頸腫瘤中的基因型還未明確。本實驗應(yīng)用PCR技術(shù)對宮頸癌及癌旁正常組織中cIAP1及Dab2進行初步檢測，以期發(fā)現(xiàn)與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究病例資料取自廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，為2004年～2006年間手術(shù)切除的41例新鮮宮頸癌標(biāo)本。新鮮組織自患者體內(nèi)取出后，立即送病理科由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師取材，取材內(nèi)容包括宮頸癌組織和癌旁正常宮頸組織，并裝入凍存管中，置于-80℃冰箱密封保存?zhèn)溆?。切片時置于-20℃冰凍切片機中，6～8 μm連續(xù)切片，切片亦置于-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

微量DNA提取試劑盒，購自廣州齊特科生物工程有限公司。cIAP1、Dab2的引物，自行設(shè)計，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。瓊脂糖凝膠，購自廣州威佳科技有限公司。50bp DNA ladder，購自北京天為時代。溴化乙錠(EB)。

實驗所用引物B-globin (產(chǎn)物長度：102bp)：S 5'-gTg CAT CTg ACT CCT gAg gAg A-3'；A 5'-CCT TgA TAC CAA CCT gCC CAg-3'。GAPDH(產(chǎn)物長度：231bp)：S 5'-ACg gAT TTg gTC gTA TTg gg-3'；A 5'-TCA TTT Tgg Agg gAT CTC gC-3'。cIAP1(產(chǎn)物長度：245bp)；S 5'-TCC CAg gTC CCT CgT ATC AA-3'；A 5'-ATC CAg CAT CAg gCC ACA AC-3'。Dab2(產(chǎn)物長度：425bp)：S 5'-TTC CCT ACT gAA CCC TAC CT-3'；A 5'-ATg AAT AAT gTT CTT CCC TC-3'。

儀器有倒置顯微鏡；臺式離心機；752型紫外分光光度計；PCR擴增儀；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；紫外透射分析儀。

1.3 方法

選取正常宮頸組織和宮頸癌這兩個起始端和終端，檢測cIAP1,Dab2。將蘇木精輕染的宮頸癌切片置于倒置顯微鏡載物臺上，10倍鏡下手持清潔手術(shù)刀片在需要切割的區(qū)域來回刻劃，用刀片蘸取少量裂解液，粘取游離的細胞，將其轉(zhuǎn)移到裝有200 μl裂解液的凍存管中，細胞大約蓋滿管底即可，然后使用微量DNA提取試劑盒提取制備DNA。將每一例樣本的正常宮頸組織和癌組織進行配對，測定所提取宮頸癌組織及癌旁正常組織DNA的OD值，在25 μl的PCR反應(yīng)體系中，均統(tǒng)一加入0.8 μg模板DNA。在同一批次分別針對待檢基因和相應(yīng)的看家基因做PCR，電泳時在同一個加樣孔中分別加入2種產(chǎn)物各8 μl，待電泳結(jié)束后，對凝膠進行染色。按照同樣的方法對每個基因均重復(fù)檢測2次。顯微切割圖片見圖1，圖2。

1.4 電泳圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理

運用bandscan4.3對電泳圖像中的各個泳帶進行灰度掃描，取2次實驗灰度值的均值。計算出待檢基因擴增產(chǎn)物灰度值與相應(yīng)看家基因擴增產(chǎn)物灰度值的比值，以這一比值作為校正值(相對灰度)，運用SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用配對樣本t檢驗處理數(shù)據(jù)，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，根據(jù)處理結(jié)果確定基因的擴增或丟失情況。

圖1 宮頸癌冰凍切片顯微切割癌巢前(100×)

圖2 宮頸癌冰凍切片顯微切割癌巢后(100×)

2 結(jié)果

2.1 cIAP1在宮頸癌中的拷貝數(shù)改變

cIAP1在宮頸癌組織中相對灰度的均值為0.716，在正常宮頸組織中相對灰度的均值為0.550，兩者經(jīng)配對樣本t檢驗，t=-3.205，P(雙)=0.006，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 Dab2在宮頸癌中的拷貝數(shù)改變

Dab2在宮頸癌組織中相對灰度的均值為0.235，在正常宮頸組織中相對灰度的均值為0.189，兩者經(jīng)配對樣本t檢驗，t=-2.519，P(雙)=0.026，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 cIAP1、Dab2擴增情況

宮頸癌組織中cIAP1、Dab2均有不同程度的擴增。

以下電泳圖中相鄰兩泳道為同一例樣本，奇數(shù)泳道為正常組織，偶數(shù)泳道為癌組織，"M"為50 bp DNA ladder，見圖3，圖4。

圖3 宮頸癌與癌旁正常宮頸組織中cIAP1的基因擴增情況

圖4 宮頸癌與癌旁正常宮頸組織中Dab2的基因擴增情況

3 討論

宮頸癌的病因已很明確，即HPV感染，但其發(fā)生發(fā)展是1個多因素、多步驟、多基因調(diào)控的長期過程。許多研究表明宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與抑癌基因的失活和癌基因的活化有關(guān)，其中研究較多并得到普遍認可的有P16等基因。P16INK4a、P14ARF基因在宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸鱗癌組織中高表達，有較高的特異性和敏感性，被認為是宮頸癌前病變及宮頸癌的診斷指標(biāo)[4]。本文研究的cIAP1和Dab2是位于宮頸腫瘤中常見染色體擴增區(qū)域的2個基因，與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，在此做一總結(jié)。

凋亡抑制蛋白(IAP)家族是Crook等于1993年首次在桿狀病毒CpGV和OPMNPV中發(fā)現(xiàn)的[5]，它是目前發(fā)現(xiàn)的惟一可以和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)直接結(jié)合而起抑制作用的蛋白家族，其抗凋亡功能遠強于bcl-2家族，至今已發(fā)現(xiàn)8個人類IAPs家族成員，cIAP1是該家族成員之一，它們在抑制細胞凋亡的過程中起著重要的作用[6,7]。Kempkensteffen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，cIAP1的過表達發(fā)生在大多數(shù)的腎細胞癌中，其表達升高對腎細胞癌具有診斷價值。目前在cIAP1與宮頸癌的關(guān)系方面的研究還比較少。Imoto等[3,9]先是發(fā)現(xiàn)了cIAP1在來自食管鱗癌細胞株的11q22上的擴增，因11q22上的擴增與多種腫瘤相關(guān)，之后又研究了11q22上的擴增與宮頸癌的放射抵抗的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在9個宮頸癌細胞株中，有2個細胞株顯示了cIAP1的擴增和與其相一致的過表達，同時與沒有cIAP1擴增的細胞株相比，也表現(xiàn)出了對由輻射誘發(fā)的細胞死亡的有效抵抗。這些都說明cIAP1的擴增在這種疾病的進展中可能起了非常重要的作用。cIAP1在宮頸腫瘤中是否過量表達，起何種作用，值得進一步研究。

本實驗結(jié)果顯示，宮頸癌組織和癌旁正常宮頸組織中cIAP1的拷貝數(shù)有差別，癌組織較正常組織擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)明顯增加，兩者相比有統(tǒng)計學(xué)意義。目前有關(guān)cIAP1與宮頸腫瘤相互關(guān)系的報道寥寥可數(shù)，說明這一基因在宮頸腫瘤中有著很大的研究空間。

Dab2位于5p13，這是宮頸腫瘤中常見的基因擴增位點。Dab2在卵巢癌、前列腺癌等惡性腫瘤中表現(xiàn)為抑癌基因[10]。有研究報道，用RNA指紋方法在上皮癌中發(fā)現(xiàn)Dab2有不同程度的缺失[11]。卵巢癌和乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)大約80%的患者Dab2蛋白缺失，其缺失與腫瘤的分級無關(guān)，與腫瘤的惡變有關(guān)。Anupam等[12]發(fā)現(xiàn)Dab2在食管鱗癌中的表達也是下降的，可能其在食管鱗癌中也是作為1種抑癌基因存在的。Martin等[13]用RT-PCR和shRNA干擾技術(shù)檢測人類正常乳腺組織和乳腺腫瘤標(biāo)本中Dab2的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常人類乳腺組織相比，乳腺腫瘤中Dab2的2種剪切形式p96和p67的表達均下降。乳腺上皮細胞中Dab2的表達下降將導(dǎo)致Ras/MAPK信號增加，這將有利于構(gòu)成轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)的信號回路，使TGFβ亞型的表達增加，而TGFβ的表達增加將導(dǎo)致基本的EMT表型出現(xiàn)。這表明在腫瘤細胞中，由于Dab2的表達受到抑制，細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的傾向會增加。有學(xué)者對鼻咽癌中Dab2蛋白的表達進行了研究，發(fā)現(xiàn)Dab2在該腫瘤中過表達，從而導(dǎo)致腫瘤細胞生長率下降，貼壁依賴性集落形成下降35%，且抑制血清誘導(dǎo)的c-Fos表達。這一研究結(jié)果表明，Dab2的過表達可以導(dǎo)致多個信號途徑的改變，提示Dab2是多個受體介導(dǎo)的信號通路中的銜接分子[14]。有關(guān)Dab2與宮頸癌關(guān)系的報道很少，僅有文獻報道，采用微點陣比較基因組雜交(CGH)的方法，對宮頸癌前病變、宮頸癌以及宮頸癌細胞株中拷貝數(shù)的變化進行了廣泛的檢測，發(fā)現(xiàn)Dab2基因在一部分宮頸病變中表現(xiàn)為擴增[15]。所以，對于宮頸癌中Dab2的基因改變情況、蛋白表達情況，及其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用需要繼續(xù)深入研究。

本實驗結(jié)果顯示，宮頸癌組織和癌旁正常宮頸組織中Dab2的拷貝數(shù)有差別，癌組織較正常組織擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)明顯增加，兩者相比有統(tǒng)計學(xué)意義。從中初步推斷Dab2在宮頸癌中表現(xiàn)為擴增；并可推測其蛋白在宮頸癌中亦為過量表達。但目前發(fā)現(xiàn)Dab2在卵巢等腫瘤中表現(xiàn)為缺失，表現(xiàn)出抑癌基因的特點。迄今對Dab2的研究尚未足夠深入，對其作為抑癌基因也尚未定論，只是在體外組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)Dab2基因轉(zhuǎn)染可抑制細胞生長，誘發(fā)細胞死亡，所以對Dab2在良惡性腫瘤中的表達值得進一步研究。本實驗中初步發(fā)現(xiàn)Dab2在宮頸癌中表現(xiàn)為擴增，其是否和p16的情況相仿，需要我們用后續(xù)可靠的實驗來驗證這個結(jié)果，并作出合理解釋。

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