殷海成 趙紅月 黃 進 賈 峰

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001)

黃河鯉是河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院自1985年經(jīng)連續(xù)8代的系統(tǒng)選育而培養(yǎng)出的優(yōu)良養(yǎng)殖品種(品種登記號:GS01-001-2004)。近10年來，隨著黃河鯉養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，各種病害也隨之增加，使得抗生素的使用逐漸增多，危害人類健康?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是被農(nóng)業(yè)部認定的魚類飼料益生菌添加劑，因其具有無殘毒、無抗藥性、不污染環(huán)境等優(yōu)點在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用。Shen等［1］對大菱鲆(Scophthatmus maximus)仔魚、Ziaei-Nejad等［2］對印度明對蝦(Fenneropenaeus indicus)、Nayak 等［3］對露斯塔野鯪(Labeo rohita)的研究均表明，在飼料中添加枯草芽孢桿菌能提高免疫功能，增強抗病力。目前，有關(guān)枯草芽孢桿菌對黃河鯉免疫功能和抗病力的研究較少。因此，本試驗擬在黃河鯉飼料中添加枯草芽孢桿菌，探討其對免疫和未免疫黃河鯉免疫功能和抗病力的影響，為枯草芽孢桿菌在該魚種養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 抗原和吞噬原的制備

依據(jù)郭玉娟等［4］的方法分別將本實驗室保存的鯉源嗜水氣單孢菌(Aeromonas hydrophila，A.hydrophila)、黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)接種在淡水瓊脂(FWA)培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)36 h后，富集菌株備用。然后在富集的菌株懸液中加入終濃度為0.5%的福爾馬林，28℃滅活24 h，即為福爾馬林滅活的A.hydrophila菌苗(抗原)和S.aureus菌體(吞噬原)。經(jīng)平皿法證實菌株已被徹底滅活后，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗飼料

1.2.1 菌株培養(yǎng)

用普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基，采用固體平板法培養(yǎng)枯草芽孢桿菌。首先將枯草芽孢桿菌(本實驗室保存)從保種斜面上轉(zhuǎn)接于普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h后，再將培養(yǎng)的菌液接種在固體平板上，培養(yǎng)24 h后收集菌體，加入適量的碳酸鈣載體，55℃烘干，稀釋法檢測菌粉活菌數(shù)，制作枯草芽孢桿菌菌粉(活菌數(shù)為1.0×1010CFU/g)。

1.2.2 飼料配制

根據(jù)鯉魚配合飼料營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 1026—1998)配制基礎(chǔ)飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加 0、1.5 ×1011、3.0 ×1011、4.5×1011CFU/kg的枯草芽孢桿菌，制成4種試驗飼料。將試驗飼料中各原料充分拌勻后，用SZLH系列高檔水產(chǎn)制粒機(洛陽市洛達特機械設(shè)備有限公司)加工成直徑為2.0 mm的顆粒飼料，于45℃下烘干，－4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗用黃河鯉購于河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院種魚繁殖場。選擇體格健壯、平均體重為(35.36±0.46)g的黃河鯉1 920尾，隨機分為8組(Ⅰ～Ⅷ組)，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)80尾，以重復(fù)為單位飼養(yǎng)于規(guī)格為2 m×2 m×1 m的水泥池中。以0.65%的無菌生理鹽水將滅活的 A.hydrophila菌苗濃度調(diào)整為1×108mL－1后，對Ⅰ～Ⅳ組試驗魚以0.2 mL/尾的劑量進行腹腔注射，作為免疫組;Ⅴ～Ⅷ組試驗魚以0.2 mL/尾的劑量腹腔注射無菌生理鹽水，作為對照組。免疫注射后，試驗魚分別投喂枯草芽孢桿菌添加量為0(Ⅰ、Ⅴ組)、1.5 ×1011(Ⅱ、Ⅵ組)、3.0 ×1011(Ⅲ、Ⅶ組)、4.5×1011CFU/kg(Ⅳ、Ⅷ組)的試驗飼料;投喂28 d后，所有試驗魚均改投Ⅰ或Ⅴ組的試驗飼料，即基礎(chǔ)飼料。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

試驗魚分組后先馴養(yǎng)2周，再進行為期56 d的正式試驗，試驗于2012年7月1日開始，至2012年8月25日結(jié)束。在整個試驗期間，水質(zhì)為曝氣自來水，采用自動循環(huán)微流水系統(tǒng)，保持溶氧6.0 mg/L，pH 6.8 左右。每日飼喂 2 次(08:00—08:30、17:30—18:00)，每日投喂量為魚體重的4.0% ～4.5%。

1.4 樣品采集

于投喂枯草芽孢桿菌前(第0天)和投喂后的第7、14、21、28天及停止投喂枯草芽孢桿菌后的第7、14天(即試驗第35、42天)的相同時間內(nèi)進行血樣收集。每重復(fù)取6尾魚，尾動脈取血;取血后，將每尾魚的血液分成2份，1份置室溫1 h，再置4℃冰箱內(nèi)4 h，以3 000 r/min離心15 min分離血清，供檢測溶菌酶活性;另1份以肝素抗凝，供測定白細胞吞噬活性。在相同時間以同樣方法對每重復(fù)4尾魚取血制備抗血清，用于測定血清抗體效價。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 白細胞吞噬活性測定

參照孟小亮等［5］介紹的方法統(tǒng)計細胞數(shù)，并按下式計算白細胞的吞噬百分比(phagocytic percentage，PP)和吞噬指數(shù)(phagocytic index，PI)。

PP(%)=(100個白細胞中參與吞噬的細胞數(shù)/100)×100;

PI=被吞噬的細菌數(shù)/吞噬細菌的細胞數(shù)。

1.5.2 血清溶菌酶活性測定

采用溶菌酶試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品)測定。

1.5.3 血清抗體效價測定

采用96孔V型血凝板按常規(guī)方法進行，反應(yīng)抗原為福爾馬林滅活的A.hydrophila菌苗。具體操作如下:取96孔微量滴定板，用微量移液管于第1孔中加入80μL生理鹽水，其余各孔分別加50μL生理鹽水;向第1孔中加入20μL的抗血清，吹吸混勻后取50μL加入到第2孔中，同樣方法加入到第3孔中，依此類推至倒數(shù)第2孔，棄去50μL，最后1孔作為對照孔;將A.hydrophila培養(yǎng)液12 000 r/min離心后用等量生理鹽水重懸，將菌懸液置于37℃，水浴加溫0.5 h;向每個孔中加入50μL菌懸液，吹吸混勻，置于37℃培養(yǎng)箱中1 h，之后移至4℃冰箱12 h，用顯微鏡觀察凝集反應(yīng)的強度。

1.6 攻毒試驗

于免疫后第42天采用 A.hydrophila(1×108個mL－1)對各組試驗魚進行攻毒。每組分別取試驗魚40尾進行攻毒試驗，按每千克體重注射3.5 mL A.hydrophila活菌懸液計算，經(jīng)胸鰭基部注射0.2 mL(體重不同時，進行微調(diào))。飼養(yǎng)觀察14 d后統(tǒng)計各組的死亡率，依下式計算免疫保護率。

免疫保護率(%)=［1－(免疫組死亡率/對照組死亡率)］×100。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用STATISTIC 6.0軟件進行雙因素方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較，組間差異顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對免疫和未免疫黃河鯉白細胞吞噬活性的影響

由表2可知，在投喂枯草芽孢桿菌前4個注射抗原的免疫組黃河鯉白細胞PP和PI無顯著差異(P ＞0.05);投喂枯草芽孢桿菌后第 7、14、21、28天，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的白細胞PP、PI均顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組之間差異不顯著(P＞0.05);投喂枯草芽孢桿菌后第14天，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的白細胞PP和PI均達到最大值，分別為(63.04 ±0.44)%、(69.99 ± 2.17)%、(68.87 ±1.27)% 和 4.44 ± 0.16、4.58 ± 0.21、4.82 ±0.02;停止投喂枯草芽孢桿菌后第7、14天，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的白細胞PP和PI雖較停喂前均有不同程度地降低，但仍顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)。上述結(jié)果說明飼料添加枯草芽孢桿菌可提高免疫黃河鯉的白細胞吞噬活性。

由表3可知，枯草芽孢桿菌對未免疫黃河鯉白細胞PP和PI的影響與對免疫黃河鯉白細胞PP和PI的影響規(guī)律完全一致，說明飼料添加枯草芽孢桿菌也能提高未免疫黃河鯉的白細胞吞噬活性;但從數(shù)值上看，同一添加量下未免疫黃河鯉白細胞PP和PI均低于免疫黃河鯉。

2.2 枯草芽孢桿菌對免疫和未免疫黃河鯉血清溶菌酶活性的影響

由表4可知，投喂枯草芽孢桿菌前4個注射抗原的免疫組黃河鯉血清溶菌酶活性無顯著差異(P ＞0.05);投喂枯草芽孢桿菌后第 7、14、21、28天，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的血清溶菌酶活性均顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)，Ⅲ(第7天除外)、Ⅳ組的血清溶菌酶活性還顯著高于Ⅱ組(P＜0.05);投喂枯草芽孢桿菌后第14天，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的血清溶菌酶活性均達到最高值，分別為(112.04±1.12)U/mL、(118.90 ±1.70)U/mL、(124.98 ±1.79)U/mL。在停止投喂枯草芽孢桿菌后第7、14天，血清溶菌酶活性雖有所下降，但Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組仍均顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ組仍顯著高于Ⅱ組(P＜0.05)。上述結(jié)果說明飼料添加枯草芽孢桿菌可提高免疫黃河鯉的血清溶菌酶活性，且添加量為3.0 ×1011、4.5 ×1011CFU/kg時效果較佳。

表2 枯草芽孢桿菌對免疫黃河鯉白細胞吞噬活性的影響Table 2 Effects of Bacillus subtilis on leukocytes phagocytic activity of immunized Huanghe carp(Cyprinus carpio Huanghe var.)

表3 枯草芽孢桿菌對未免疫黃河鯉白細胞吞噬活性的影響Table 3 Effects of Bacillus subtilis on leukocytes phagocytic activity of unimmunized Huanghe carp(Cyprinus carpio Huanghe var.)

由表5可知，枯草芽孢桿菌對未免疫黃河鯉血清溶菌酶活性的影響與對免疫黃河鯉血清溶菌酶活性的影響規(guī)律完全一致，說明投喂含枯草芽孢桿菌飼料也能提高未免疫黃河鯉的血清溶菌酶活性，以 3.0 ×1011、4.5 ×1011CFU/kg添加量為佳;但從數(shù)值上看，同一添加量下未免疫黃河鯉的血清溶菌酶活性均低于免疫黃河鯉。

表4 枯草芽孢桿菌對免疫黃河鯉血清溶菌酶活性的影響Table 4 Effects of Bacillus subtilis on serum lysozyme activity of immunized Huanghe carp(Cyprinus carpio Huanghe var.) U/mL

表5 枯草芽孢桿菌對未免疫黃河鯉血清溶菌酶活性的影響Table 5 Effects of Bacillus subtilis on serum lysozyme activity of unimmunized Huanghe carp(Cyprinus carpio Huanghe var.) U/mL

2.3 枯草芽孢桿菌對免疫和未免疫黃河鯉血清抗體效價的影響

由表6可知，4個注射抗原的免疫組黃河鯉的血清抗體效價隨試驗天數(shù)的增加逐漸上升，并均于第21天達到最高值，之后有所降低。其中，Ⅲ組黃河鯉的血清抗體效價最高，其幾何平均值為486.7;其次是Ⅳ組，為 372.6;再次是Ⅱ組，為234.6;而Ⅰ組最低，為192.8。上述結(jié)果說明飼料添加枯草芽孢桿菌可提高免疫黃河鯉的血清抗體效價，且添加量為 3.0 ×1011、4.5 ×1011CFU/kg時提高效果明顯。4個未注射抗原的對照組黃河鯉的血清抗體效價多為1∶＜4，僅有個別個體達到1∶8。

2.4 枯草芽孢桿菌對 A.hydrophila攻毒后黃河鯉免疫保護率的影響

由表7可知，4個注射抗原的免疫組黃河鯉均獲得了一定的免疫保護率，說明飼料添加枯草芽孢桿菌能提高免疫黃河鯉的免疫功能，增強抗病毒能力。當(dāng)枯草芽孢桿菌添加量為4.5×1011CFU/kg時，免疫黃河鯉獲得了最高的免疫保護率。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌對免疫和未免疫黃河鯉白細胞吞噬活性、血清溶菌酶活性的影響

魚類的非特異性免疫系統(tǒng)在其抵抗病原菌過程中發(fā)揮著十分重要的作用，溶菌酶是非特異性免疫因子，能提高白細胞的吞噬活性［6－7］。因此，通過測定魚類血液中白細胞吞噬活性以及血清中的溶菌酶活性，可以從一定程度上反映被測魚類的非特異性免疫狀態(tài)［8］。已有研究證實，口服枯草芽孢桿菌后，羅非魚［9］、石斑魚［10］、虹鱒［11］等魚類血清溶菌酶活性均顯著提高［9－11］。本研究中發(fā)現(xiàn)，投 喂 添 加 1.5 × 1011、3.0 × 1011、4.5 ×1011CFU/kg枯草芽孢桿菌飼料后黃河鯉的白細胞吞噬活性和血清溶菌酶活性也顯著提高;而且，隨著飼料中枯草芽孢桿菌添加量的升高，黃河鯉白細胞吞噬活性和血清溶菌酶活性具有上升的趨勢。Marja等［12］研究表明，在一定程度上，血清溶菌酶活性與循環(huán)系統(tǒng)中的白細胞數(shù)量變化存在正相 關(guān) 關(guān) 系。Nayak 等［3］發(fā) 現(xiàn)，以 含 1.0 ×108CFU/g芽孢桿菌的飼料飼喂已感染 A.hydrophila的露斯塔野鯪(Labeo rohita)后，其白細胞數(shù)量和白細胞吞噬活性均顯著提高。有研究表明，在腸道內(nèi)枯草芽孢桿菌能夠釋放某些抗菌物質(zhì)，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能，同時激活腸道淋巴組織和T、B淋巴細胞，從而促進巨噬細胞吞噬與殺菌活性［13］。Tejada-Simon 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌可以改善動物腸道菌群，同時提高血液中白細胞數(shù)量和白細胞吞噬活性，并增強溶菌酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌細胞壁的主要成分葡聚糖具有提高魚類的非特異性免疫功能的作用［15］，細胞壁的脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖、磷壁酸復(fù)合物也具有很強的免疫佐劑活性作用，能夠提高魚類的免疫力［16］。潘康成等［13］研究認為，飼用芽孢桿菌可提高水產(chǎn)動物免疫識別力，誘導(dǎo)T、B淋巴細胞和巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子，通過淋巴細胞再循環(huán)而活化全身免疫系統(tǒng)，從而增強機體的非特異性和特異性免疫功能。

表6 枯草芽孢桿菌對免疫和未免疫黃河鯉血清抗體效價的影響Table 6 Effects of Bacillus subtilis on serum antibody titer of immunized and unimmunized Huanghe carp(Cyprinus carpio Huanghe var.)

安利國等［17］利用 A.hydrophila滅活苗免疫鯉魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鯉魚的溶菌酶活性和白細胞吞噬活性顯著提高。這與本試驗結(jié)果相同，而本試驗還發(fā)現(xiàn)投喂枯草芽孢桿菌后，注射抗原的免疫組黃河鯉的白細胞吞噬活性和血清溶菌酶活性均顯著高于未注射抗原的對照組黃河鯉，說明枯草芽孢桿菌和疫苗對黃河鯉的非特異性免疫力的提高具 有 協(xié) 同 作 用。Rajesh等［18］研 究 發(fā) 現(xiàn)，經(jīng)A.hydrophila疫苗免疫后的露斯塔野鯪，再投喂含枯草芽孢桿菌的飼料后魚體非特異性免疫指標(biāo)亦顯著提高。類似結(jié)果在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)［10，19］的研究中也得到驗證。

表7 A.hydrophila攻毒后黃河鯉的死亡率和免疫保護率Table 7 Mortality and immune protection rate of Huanghe carp(Cyprinus carpio Huanghe var.)after challenged with A.hydrophila

3.2 枯草芽孢桿菌對黃河鯉血清抗體效價及免疫保護率的影響

益生菌或多糖具有提高水產(chǎn)動物免疫保護和機體抗體水平的作用已有很多報道［20］。Rajesh等［18］研究證明枯草芽孢桿菌具有良好的佐劑作用:鯉魚經(jīng)A.hydrophila疫苗免疫后，再投喂枯草芽孢桿菌，其先天免疫功能明顯增強。孫建和等［21］將A.hydrophila外毒素與多糖偶聯(lián)免疫鯽后發(fā)現(xiàn)其血清抗體出現(xiàn)早，抗體效價高且持續(xù)時間長。從本試驗結(jié)果看，注射抗原的黃河鯉白細胞吞噬活性和血清溶菌酶活性增強效果高于未注射抗原的黃河鯉，血清抗體效價和存活率也有明顯提高，表明枯草芽孢桿菌與A.hydrophila疫苗聯(lián)合使用效果優(yōu)于單獨使用疫苗。但也有文獻報道A.hydrophila對魚類免疫保護率低的現(xiàn)象［22］。Post［23］給虹鱒注射不加佐劑的熱滅活 A.hydrophila 疫苗，免疫保護率為 62.5%;Schacte［24］采用皮下注射A.hydrophila免疫斑點叉尾，免疫保護率只有37.5%。這種免疫保護率的差異可能與A.hydrophila菌種的差異有關(guān)。Schroer等［25］研究發(fā)現(xiàn)，采用2種不同的A.hydrophila菌株制成的免疫疫苗，一種A.hydrophila 60對鯉魚的腸道黏膜免疫具有明顯的促進作用，而另外一種A.hydrophila 38則明顯破壞了試驗魚的腸道黏膜結(jié)構(gòu)，降低了魚類對致病菌的抵抗能力。此外，疫苗對試驗魚免疫保護作用的差異與試驗魚之間存在較高的相關(guān)性。Ardó等［26］的研究就證實，即使同為鯉魚，亦存在 A.hydrophila敏感系和 A.hydrophila抵抗系的區(qū)別，且這2種類型的鯉魚在基因上存在較大差異。

4 結(jié)論

飼料添加枯草芽孢桿菌可提高免疫和未免疫黃河鯉的免疫功能和抗病力，建議添加量為3.0～4.5 ×1011CFU/kg。

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