包萬華 王加啟 卜登攀 姜雅慧 金恩望 雒秋江

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

動(dòng)物活體試驗(yàn)是研究瘤胃發(fā)酵理想的方法，但存在試驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高且易受試驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異及應(yīng)激等諸多不利因素影響，研究者們便設(shè)計(jì)了體外連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行瘤胃模擬發(fā)酵試驗(yàn)。目前國(guó)外具有代表性的連續(xù)模擬培養(yǎng)系統(tǒng)主要有Hoover等［1］在 1976年設(shè)計(jì)的持續(xù)人工瘤胃、Teather等［2］在1988年設(shè)計(jì)的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)和Martínez等［3］在 2009 年改進(jìn)的自動(dòng)控制連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng);我國(guó)較有代表性的有王加啟等［4］在1993年設(shè)計(jì)的瘤胃持續(xù)模擬裝置(RSI)和孟慶翔［5］在1999年設(shè)計(jì)的雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)(CCS)。沈維軍等［6］結(jié)合瘤胃發(fā)酵的特征和目前所應(yīng)用的雙外流瘤胃模擬裝置的優(yōu)缺點(diǎn)，設(shè)計(jì)出一種新型固液氣分流式瘤胃模擬系統(tǒng)。瘤胃液稀釋率是體外瘤胃模擬系統(tǒng)的主要運(yùn)行參數(shù)之一，也是影響瘤胃發(fā)酵和瘤胃微生物生長(zhǎng)的重要因素之一。但目前對(duì)于稀釋率對(duì)瘤胃發(fā)酵影響的研究報(bào)道不盡一致，部分研究者［7-9］認(rèn)為在體外瘤胃模擬培養(yǎng)發(fā)酵中增加液相稀釋率并減少固相的滯留時(shí)間，可以提高揮發(fā)性脂肪酸(VFA)產(chǎn)量并有利于微生物的生長(zhǎng)，而另外一些研究者［10-11］卻認(rèn)為稀釋率對(duì)VFA、瘤胃微生物的生長(zhǎng)沒有影響，因此有必要研究稀釋率到底對(duì)瘤胃發(fā)酵有多大的影響、稀釋率在哪一范圍內(nèi)更有利于瘤胃的發(fā)酵及更適合本模擬系統(tǒng)。本試驗(yàn)通過考察不同稀釋率下新型固液氣分流式瘤胃模擬系統(tǒng)中原蟲數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化、人工瘤胃的發(fā)酵參數(shù)和飼料常規(guī)養(yǎng)分消失率的變化，探究稀釋率對(duì)新型固液氣分流式瘤胃模擬系統(tǒng)發(fā)酵效果的影響，從而確定出本裝置穩(wěn)定運(yùn)行條件下的最佳稀釋率，同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證此裝置的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 新型固液氣分流式瘤胃模擬系統(tǒng)及緩沖液(人工唾液)

新型固液氣分流式瘤胃模擬系統(tǒng)(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所研制)，包括發(fā)酵裝置、攪拌裝置、緩沖液注入裝置、排氣裝置、排液裝置、排固裝置和恒溫裝置。發(fā)酵裝置作為核心部分，由12個(gè)有效體積為(1 000±10)mL的發(fā)酵罐組成。人工瘤胃操作方法參照沈維軍等［6］的方法。人工唾液采用 McDougall［12］設(shè)計(jì)的配方，待試劑全部溶解后，加入CaCl2避免產(chǎn)生白色沉淀，向緩沖液中持續(xù)通入CO2使溶液pH為6.9±0.1。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及管理

試驗(yàn)動(dòng)物為3頭安裝永久性瘺管的健康荷斯坦奶牛。每天于08:00和20:00飼喂全混合日糧，全天自由飲水。人工瘤胃試驗(yàn)用飼糧與試驗(yàn)動(dòng)物的飼糧組成一致，飼糧組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))為:苜蓿干草 8.33%，羊草 16.67%，玉米青貯25.00%，玉 米 26.67%，麥 麩 6.89%，豆 粕13.75%，石粉 1.11%，磷酸氫鈣 0.61%，食鹽0.44% ，預(yù)混料 0.50%。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)4個(gè)處理，各處理稀釋率分別為 6%/h、8%/h、10%/h和12%/h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理1個(gè)發(fā)酵罐。試驗(yàn)期為10 d。

1.4 瘤胃液的采集和接種

采集晨飼2 h后的3頭供體奶牛的瘤胃液，混合均勻后用4層紗布過濾后放入保溫瓶迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。向每個(gè)發(fā)酵罐按緩沖液與瘤胃液為1∶1的比例接種瘤胃液。整個(gè)操作過程需要持續(xù)通入氮?dú)庖员３职l(fā)酵罐的厭氧環(huán)境。接種后每天向發(fā)酵罐中投放40 g(干物質(zhì))飼糧。

1.5 樣品采集與分析

1.5.1 采樣與補(bǔ)料

每天分別在08:00和20:00補(bǔ)料前從發(fā)酵罐中部采集5 mL發(fā)酵液，將發(fā)酵液與甲基綠染色液(MFS)［13］以 1∶2 混合染色，用于原蟲數(shù)量的測(cè)定，從集液瓶中采集1 mL發(fā)酵液用于氨態(tài)氮(NH3-N)濃度、VFA含量和酶活性的測(cè)定，再采集10 mL發(fā)酵液用于微生物蛋白質(zhì)(MCP)產(chǎn)量等指標(biāo)的測(cè)定。同時(shí)從發(fā)酵罐底部收集消化后過篩網(wǎng)的食糜于尼龍袋中用于飼料常規(guī)養(yǎng)分的測(cè)定。待取樣完畢后通過發(fā)酵罐蓋上的投料口向每個(gè)發(fā)酵罐投入20 g(干物質(zhì))的飼糧，整個(gè)操作過程持續(xù)通入氮?dú)獗３謪捬酢?/p>

1.5.2 測(cè)定方法

固體食糜樣品中的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)(CP)和中性洗滌纖維(NDF)等營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定參照《飼料分析與檢測(cè)》［14］中的方法。發(fā)酵液pH由安裝在罐內(nèi)的pH電極自動(dòng)檢測(cè)，并自動(dòng)錄入計(jì)算機(jī)。所采集的溢流液樣品按3∶1加入25%的偏磷酸，搖勻后在12 000×g下離心20 min，取上清液采用靛酚比色法［15］進(jìn)行NH3-N濃度的測(cè)定。采集的樣品按10∶1比例加入25%的偏磷酸處理后用氣相色譜法測(cè)定VFA含量。將從發(fā)酵罐中部取得的5 mL溢流液加入10 mL甲基綠染色液，搖勻靜置過夜，采用Sedgewick-Rafter原蟲計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀測(cè)原蟲數(shù)量［16］。樣品中MCP產(chǎn)量采用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定［17］。將溢流液樣品1 000×g離心5 min后取上清液，參考Yue等［18］的方法用酶標(biāo)儀測(cè)定纖維素類酶活性。各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消失率按以下公式計(jì)算:

1.5.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行初步的處理和統(tǒng)計(jì)，采用SAS 9.1.3 Mix模型進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)用平均值表示，P＜0.05為顯著性水平，P＜0.01為極顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 稀釋率對(duì)發(fā)酵參數(shù)的影響

由表1可以看出，當(dāng)稀釋率由6%/h提高到10%/h時(shí)，發(fā)酵液 pH極顯著上升(P＜0.01)，NH3-N濃度極顯著下降(P＜0.01)，且當(dāng)上升到12%/h時(shí)，NH3-N濃度顯著高于稀釋率為10%/h時(shí)。稀釋率由6%/h提高到10%/h時(shí)，總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)和戊酸濃度分別極顯著下降了48.59%和 16.78%(P ＜0.01)，但當(dāng)稀釋率達(dá)到12%/h時(shí)，并沒有繼續(xù)下降的趨勢(shì)(P＞0.05)。高稀釋率［10%/h(P＜0.05)、12%/h(P＞0.05)］下的丙酸濃度高于低稀釋率(6%/h、8%/h)，稀釋率為6%/h時(shí)，戊酸濃度顯著或極顯著高于其他各處理(P＜0.05或 P＜0.01)。乙酸/丙酸在10%/h稀釋率條件下顯著低于稀釋率為6%/h和8%/h(P ＜0.05)。

表1 稀釋率對(duì)發(fā)酵參數(shù)的影響Table 1 Effects of dilution rate on fermentation parameters

2.2 稀釋率對(duì)原蟲數(shù)量、纖維素類酶活性及MCP產(chǎn)量的影響

從圖1可以看出，各個(gè)發(fā)酵液中的原蟲數(shù)量在試驗(yàn)2 d后有急劇下降的趨勢(shì)，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延續(xù)，原蟲數(shù)量的變化趨勢(shì)漸平緩。5～10 d時(shí)，稀釋率為6%/h、8%/h、10%/h和12%/h的發(fā)酵液的原蟲數(shù)量分別基本維持在0.84×104mL-1、1.21 × 104mL-1、1.08 × 104mL-1和 0.96 ×10 mL-1。

圖1 發(fā)酵10 d內(nèi)稀釋率對(duì)原蟲數(shù)量的影響Fig.1 Effects of dilution rate on protozoza number during 10 days of fermentation

從表2可以看出，隨著稀釋率從6%/h增高到10%/h，木聚糖酶的活性極顯著降低(P＜0.01)，微晶纖維素酶和羧甲基纖維素酶的活性也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。隨著稀釋率由8%/h提高到10%/h，MCP產(chǎn)量顯著降低了22.81%(P ＜0.05)。

2.3 稀釋率對(duì)飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體外消失率的影響

從表3可以看出，隨著稀釋率由6%/h增加到10%/h，CP體外消失率升高了 15.56%(P＜0.01)，當(dāng)稀釋率為12%/h時(shí)，CP體外消失率雖比10%/h時(shí)下降了0.88%，但未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。稀釋率為10%/h和12%/h的2個(gè)處理，NDF體外消失率顯著高于另外2個(gè)處理(P＜0.05)。稀釋率對(duì)干物質(zhì)體外消失率和ADF體外消失率無顯著影響(P＞0.05)。

3 討論

3.1 稀釋率對(duì)發(fā)酵參數(shù)的影響

Crawford 等［19］和Meng 等［20］的研究都曾證明增加發(fā)酵液的稀釋率可以導(dǎo)致pH升高，可能由于高稀釋率(10%/h、12%/h)條件下，緩沖液注入的量比較大，從而沖淡了發(fā)酵罐內(nèi)容物而致pH上升。本次試驗(yàn)得出NH3-N濃度隨著稀釋率水平的提高極顯著下降的結(jié)果與王加啟等［4］和Firkins等［21］的研究結(jié)果相一致;而 Hoover等［10］研究的試驗(yàn)則表明增加稀釋率可以使發(fā)酵液NH3-N濃度升高，產(chǎn)生不一致結(jié)果的原因可能是雖然試驗(yàn)采用的液相稀釋率相似，但固體食糜在發(fā)酵罐中滯留時(shí)間不同，從而影響了發(fā)酵液pH，pH對(duì)溢流液NH3-N 濃度也能產(chǎn)生影響［11，22］。Ribeiro 等［23］曾得出pH在一定程度上是瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物TVFA在反芻動(dòng)物瘤胃中的濃度的體現(xiàn)，TVFA越低，pH就越高，反之則越低，本試驗(yàn)的結(jié)果與此也相一致。Crawford 等［19］曾研究了 7%/h、11%/h 和 15%/h 3水平的稀釋率對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，結(jié)果顯示稀釋率從7%/h提高到11%/h時(shí)TVFA濃度呈上升趨勢(shì)，而當(dāng)稀釋率達(dá)到15%/h時(shí)，又呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但并無顯著差異;Patterson等［24］也曾證明出稀釋率達(dá)到10%/h時(shí)，TVFA濃度、乙酸和丙酸的濃度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。TVFA濃度受稀釋率影響顯著降低的原因可能由于裝置在較高稀釋率條件下，發(fā)酵液的單糖還沒有來得及被微生物降解成VFA，便已經(jīng)隨其余發(fā)酵終產(chǎn)物同溢流液流出罐外。

表2 稀釋率對(duì)纖維素類酶活性及MCP產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of dilution rate on cellulase activities and MCP production

表3 稀釋率對(duì)飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體外消失率的影響Table 3 Effects of dilution rate on in vitro disappearance rate of dietary nutrients

3.2 稀釋率對(duì)原蟲數(shù)量、纖維素類酶活性及MCP產(chǎn)量的影響

本試驗(yàn)中所有發(fā)酵罐的原蟲數(shù)量在試驗(yàn)第2天均大量下降。試驗(yàn)期內(nèi)，原蟲數(shù)量的隨著稀釋率從6%/h上升到8%/h而顯著上升，但當(dāng)稀釋率從8%/h上升到12%/h時(shí)，原蟲數(shù)量又極顯著下降，這可能是由于6%/h的最低稀釋率條件下，注入到發(fā)酵罐的人工唾液量較少，引起發(fā)酵產(chǎn)物和部分飼料的積累，導(dǎo)致pH下降而不利于罐中的原蟲生長(zhǎng)。但稀釋率太大，附著在飼料顆粒生存的原蟲會(huì)隨著過高外流速度的溢流液而流出罐外。進(jìn)入試驗(yàn)后期，雖然原蟲數(shù)量較接種時(shí)牛體的原蟲數(shù)量低，但都可以維持在104的數(shù)量級(jí)，這與Hoover等［1］采用的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)所得出的結(jié)果相近，他們得出原蟲數(shù)量能夠維持在6.7×104mL-1。Crawford等［19］的研究結(jié)果則顯示瘤胃稀釋率對(duì)原蟲數(shù)量無顯著影響。研究結(jié)果不一致可能由于系統(tǒng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)存在部分差異，以及瘤胃液供體牛的品種狀況以及接種時(shí)采用的瘤胃液與緩沖液比例不同等原因。

本試驗(yàn)中木聚糖酶活性隨稀釋率的升高而降低，而 Martínez 等［3］曾得出木聚糖酶活性在高稀釋率(5.42%/h)條件下，顯著高于低稀釋率(3.78%/h)條件，結(jié)果不一致的原因是模擬裝置本身的差異，且選用的稀釋率范圍不同，本試驗(yàn)采用的稀釋率的范圍為 6%/h ～ 12%/h，Martínez等［3］采用的范圍是 3.78%/h ～5.42%/h。提高稀釋率可以降低溢流液中MCP產(chǎn)量的結(jié)果與Meng等［20］的研究結(jié)果相似，他們指出當(dāng)稀釋率從2.5%/h提高到10%/h時(shí)，MCP產(chǎn)量逐漸增加，但當(dāng)稀釋率超過10%/h時(shí)，MCP產(chǎn)量卻開始下降。瘤胃和發(fā)酵液的厭氧微生物利用飼糧中的蛋白質(zhì)降解成的氨基酸等作為氮源，利用飼糧有機(jī)物發(fā)酵產(chǎn)生的VFA和能量等合成MCP。當(dāng)稀釋率高于10%/h，食糜停留在瘤胃中時(shí)間過短，以致影響厭氧微生物的增殖，同時(shí)降低并帶走發(fā)酵終產(chǎn)物，從而也就降低了MCP產(chǎn)量。

3.3 稀釋率對(duì)飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消失率的影響

雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于飼糧營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)定［4］。本試驗(yàn)中得出稀釋率對(duì)飼糧干物質(zhì)體外消失率無顯著影響，這與王照華等［25］研究得出稀釋率對(duì)飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消失率無顯著影響基本一致。孟慶翔等［5］采用稀釋率為0.05%/h～0.15%/h進(jìn)行雙外流模擬試驗(yàn)，得出稀釋率對(duì)干物質(zhì)、有機(jī)物和CP的體外消失率均沒有顯著影響。但也有部分學(xué)者研究得出提高稀釋率能夠顯著的增加干物質(zhì)及NDF等的體外消失率［3，26］，Meng 等［20］曾發(fā)現(xiàn)增加稀釋率可以降低 3種不同飼糧的干物質(zhì)消失率。Hoover等［10］得出在低稀釋率(4%/h、8%/h)條件下時(shí)，CP消失率較高，可以達(dá)到60% ～70%，且隨著稀釋率的增高，CP消失率降低到不多于40%。導(dǎo)致這些不同研究結(jié)果的原因可能是由于各個(gè)雙外流培養(yǎng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、試驗(yàn)飼糧精粗比、飼糧的粉碎程度等存在差異。這些研究結(jié)果表明在一定范圍內(nèi)提高稀釋率，不會(huì)導(dǎo)致瘤胃中飼糧消失率降低。

4 結(jié)論

稀釋率能夠影響新型固液氣分流式瘤胃模擬系統(tǒng)的發(fā)酵情況，稀釋率為8%/h時(shí)，原蟲數(shù)量以及纖維素類酶活性、各瘤胃發(fā)酵參數(shù)更加有利于發(fā)酵，因此可推薦作為本系統(tǒng)進(jìn)行應(yīng)用試驗(yàn)研究時(shí)的最優(yōu)運(yùn)行條件。

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